液质联用法测定坚果类的苯丁锡

2020-12-01万承波林黛琴王婷婷钟永生杨标斌黄磊

食品工业 2020年11期

万承波，林黛琴，王婷婷，钟永生，杨标斌，黄磊

江西省产品质量监督检测院（南昌 330029）

苯丁锡（Fenbutatin oxide）又名螨完锡，属于一种有机锡农药，是一种杀螨剂，分子式为C60H78OSn2，对有机氯和有机磷产生抗性的螨类害虫能有效防治，被广泛用于果蔬、茶树等作物，易通过食物链进入生物体内产生生物富集，对人体和动物有一定的毒性。目前我国、日本及欧盟等均对食品中的苯丁锡作出相应的限量规定。我国在黄瓜、香蕉等蔬菜水果、坚果类食品中均有限量规定，GB 2763—2019中限量范围在0.5～10 mg/kg之间，推荐方法为SN 0592—1996《出口粮谷及油籽中苯丁锡残留量》；日本肯定列表制度规定部分水果蔬菜中的苯丁锡残留限量为0.05 mg/kg；欧盟关于苯丁锡使用限量规定最为严格，在蔬菜、谷物、牛奶鸡蛋等动物产品中的最大残留限量为0.01 mg/kg。

目前国内报道的有机锡类农药的检测分析方法主要有气相色谱（FPD、ECD）法[1-5]、气相色谱质谱法[6-7]、液相色谱质谱法[8-10]、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[11-12]、红外光谱法[13]等。有机锡化合物沸点高，气相色谱直接进样不能气化，衍生反应后还需要净化才能进样，缺点主要集中在过程繁琐、衍生条件苛刻以及存在不稳定性且耗时费力，难以实现通量检测；目前我国对苯丁锡有限量值规定的包括蔬菜、水果、干制水果以及坚果类，基质种类较为复杂，采用紫外光谱法容易造成假阳性的存在；采用液相色谱串联质谱法无需衍生、操作简便、节省溶剂、稳定性好，适合高通量检测。

检索文献发现，目前报道的苯丁锡含量检测方法的适用范围局限在蔬菜、水果、粮谷、畜禽肉中，尚未有坚果类中苯丁锡含量的检测方法报道，油脂油料基质复杂，含有大量的蛋白质、脂肪等干扰物，建立一种液相色谱串联质谱法测定坚果类中苯丁锡含量的分析方法很有必要。此次试验拟针对坚果类基质，选取比较有代表性的杏仁、核桃仁为研究对象，建立一种简便、快速且准确度高的液相色谱串联质谱法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters-UPLC I-Class高效液相色谱仪，AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500质谱仪；空气控温摇床仪KS400i；离心机3K15（Sigma）；电子天平（感量0.1 mg，Sartorius，德国）；涡旋振荡仪（IKA）。

苯丁锡标准品（纯度98.0%，Bepure）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，40～60 μm，安捷伦，美国）；十八烷基硅烷键合硅胶（C18，40～60 μm，安捷伦，美国）；乙酸铵（色谱级，阿拉丁公司）；无水硫酸镁（分析纯，广州化学试剂）；氯化钠（分析纯，广州化学试剂）；甲酸（色谱级，阿拉丁公司）；乙腈、正己烷（色谱纯，默克尔公司）。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱，Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μ m）；柱温，40 ℃；流动相A，5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水；流动相B，甲醇；流速，0.4 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.3 min，10% B；0.3～2 min，10%～100%B；2～5 min，100% B；5～5.1 min，100%～10% B；5.1～6 min，10% B。进样体积：2 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源，电喷雾离子源（ESI）；扫描方式，正离子模式；离子源温度，550 ℃；CUR，0.207 MPa；IS，5 500 V；GS1，0.379 MPa；GS2，0.379 MPa。扫描模式：多重反应监测MRM模式，见表1。

表1 质谱条件

1.3 测定步骤

1.3.1 标准溶液配制

苯丁锡储备液的配制：准确称取25.0 mg苯丁锡于250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得到100 μg/mL标准储备溶液，于4 ℃保存。

1.3.2 样品前处理

称取4.0 g（精确至0.01 g）试样置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL正己烷饱和的乙腈，以300 r/min振荡提取40 min，加入4.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，剧烈振荡2 min，离心分层。取2 mL上清液至加有40 mg C18粉的2.5 mL离心管中，涡旋1 min，离心3 min。准确移取1 mL上清液，于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水（3∶2，V/V）定容，过膜上机待测。

1.3.3 定性及定量测定

以样品中目标化合物色谱峰的保留时间和相应基质标准色谱峰的保留时间比较，误差绝对值应不超过2.5%。为减少基质对目标物定量测定的影响，该方法采用基质标准曲线-外标法定量测定，标准溶液采用基质混合标准工作溶液绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 仪器方法优化

2.1.1 流动相种类以及流速的优化

分别考察了0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸铵）溶液-乙腈以及0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸铵）溶液-甲醇2种流动相体系。结果显示，同等浓度的苯丁锡标准溶液在0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸铵）溶液-乙腈体系中响应低且色谱峰展宽。分析原因：乙腈的洗脱能力比甲醇强，同等比例的乙腈和甲醇，含乙腈的溶解液会导致峰展宽现象更为严重，且甲醇提供质子的能力比乙腈强，甲醇更适合正离子监测模式，最终采用0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸铵）溶液-甲醇的流动相体系。

进一步对流动相流速进行优化，考察了0.3，0.4和0.5 mL/min三种流速。结果显示，当流速增加至0.4 mL/min后，苯丁锡的峰宽无明显变化。此外，出于对仪器以及色谱柱的保护，最终选择0.4 mL/min的流速。

2.1.2 质谱条件的优化

此次试验采用针泵流动注射进样，在ESI正离子模式下进行母离子扫描，从图1中可见其存在多簇离子峰，与仪器自带软件功能Isotopic distribution得出的同位素分布丰度图吻合，已报道的液相色谱质谱法均采用517.2作为母离子，此次试验创新性地选取响应最强的519.2（C30H39Sn-）作为母离子。苯丁锡分子式为C60H78OSn2，锡含有10个稳定的同位素（质量数分别为112，114，115，116，117，118，119，120，122和124）[14]，其中120（Sn）的丰度最大，这进一步解释了选取519.2作为苯丁锡母离子的合理性，故选择响应较强的519.2作为母离子。进一步进行子离子扫描（Product ion scan），选择463.1，351.0和196.8为子离子（图2）。选择517.2作为母离子，进一步扫描子离子并优化碰撞能（CE）、去簇电压（DP）等参数，采用MRM模式进样，虽然也可以满足灵敏度要求，但选用519.2作为母离子灵敏度更高，更有利于方法研究。

2.2 前处理方法优化

2.2.1 提取溶剂选择

此次试验对象为坚果类基质，其富含油脂和蛋白，苯丁锡为极性分子，难溶于大多数有机溶剂；分别考察了正己烷、乙腈、正己烷饱和的乙腈为提取溶剂，结果发现正己烷提取效率最低，乙腈和正己烷饱和的乙腈最好，但是正己烷饱和的乙腈提取到的干扰物质更少，主要是因为样品基质富含油脂缘故。最终选取正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 除水剂用量的选择

无水硫酸镁相较无水硫酸钠具有更好的吸水能力，考察了1，2，3，4和5 g无水硫酸镁对苯丁锡提取回收率的影响。随着无水硫酸镁用量的增加，回收率逐渐提高，当用量大于4 g时，苯丁锡回收率逐渐下降，故最终选择添加4 g无水硫酸镁。

2.2.3 净化材料的选择

目前农药残留测定中运用比较广泛的分散固相萃取净化材料主要有石墨炭黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅胶键合相（C18）等，此次试验主要考察以上3种净化材料比例用量对目标物提取效率的影响。结果发现，加入GCB、PSA净化后，样品中苯丁锡回收率明显下降。分析原因是苯丁锡为多苯环结构物质，石墨炭黑是平面结构材料，相似相溶，可能导致苯丁锡被吸附从而导致回收率下降；乙二胺-N-丙基硅烷对苯丁锡有吸附，可能是由于分子间的作用力。C18粉对于小极性和非极性干扰物具有很好的吸附作用，可吸附脂肪等干扰物，坚果类基质的干扰物主要是蛋白质和脂肪，进一步对C18用量做了优化。将1.2.1前处理提取液分别用10，20，40，60和100 mg C18粉进行净化，结果显示，当C18粉用量大于40 mg时，回收率逐渐降低（图3）；故C18粉的最佳用量为40 mg。

图1 苯丁锡全扫质谱图-同位素分布图

图3 不同质量C18粉用量对苯丁锡回收率影响

2.3 线性范围和定量限

准确称取4.0 g阴性样品，按照1.2.1处理方法处理，制得若干基质空白提取液，并以之逐级稀释得到一系列质量浓度（0.10，0.20，0.50，1.00，2.00和5.00 ng/mL），以苯丁锡定量离子峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为Y=6.8×104X+1.2×105（r=0.999 4）。定量限以10倍S/N计算，该方法定量限为0.50 μg/kg。