Ba2+对南美白对虾酚氧化酶活性和结构的影响

佟抒洋，张书琪，郭雨晴，张俊健，张弛，吕艳芳

渤海大学食品科学与工程学院（锦州 121013）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）广泛存在于生物界，节肢动物体中一般称为酚氧化酶，植物中一般称为多酚氧化酶，脊椎动物、微生物和软体动物中一般称为酪氨酸酶。在生物体内，多酚氧化酶是黑色素合成的关键酶[1]，水果、蔬菜、对虾等食品的褐变均与其活性有关，它是一种结构复杂的含铜金属氧化酶。那么，金属离子对其活性和结构有怎样的影响呢？蒋经伟等[2]在研究菲律宾哈仔漆酶型酚氧化酶生化特性时发现，Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+能明显抑制该酶的活性；周燕燕[3]研究金银花中的多酚氧化酶时发现，不同浓度Fe2+、K+、Mg2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+等金属离子对酚氧化酶的作用效果不同；Zheng等[4]研究汤普森无籽葡萄多酚氧化酶时发现，Zn2+和K+能够抑制酶的活性，而Mg2+和Cu2+可以激活酶的活性；彭维等[5]研究发现不同的金属离子对木聚糖酶和葡聚糖酶活力具有不同的影响，Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+能激活葡聚糖酶活性，但Cu2+会抑制葡聚糖酶的活性，Na+、K+、Ca2+能激活木聚糖酶的活力。

近几年随着实验技术的更新，通过红外光谱、紫外光谱、荧光光谱等研究酶的结构变化，可以了解酶结构变化与其活性的关系。此次试验用不同浓度的Ba2+对南美白对虾酚氧化酶进行作用，然后研究处理后的南美白对虾酚氧化酶活性和结构的变化，从而为金属离子对南美白对虾PO酶活性与结构的影响研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南美白对虾（Penaeus vannamei）养殖于辽宁锦州渤海湾，购买时为活虾，将虾保持鲜活状态运到实验室，用冰猝死，将其头胸部剪下，贮藏于-80 ℃超低温冰箱备用。

L-多巴（L-β-（3, 4-二羟基苯）-丙氨酸，L-DOPA）（BR级）、十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35，Sigma-Aldrich），北京中生瑞泰科技有限公司；曲酸（纯度99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DEAE-琼脂糖凝胶FF（DEAE Sepharose Fast Flow）、葡聚糖凝胶G-100（Sephadex G-100），GE-Healthcare Amersham公司；其他试剂均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；蛋白电泳仪、GS-800图像扫描仪，美国Bio-Rad公司；Milli-Q超纯水装置，美国Millipore公司；DK8D型电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司；Biofuge stratos台式冷冻高速离心机，美国Thermo Scientific公司；Scimitar2000 Near傅里叶变换红外光谱仪，美国安捷伦公司；970CRT型荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；蛋白质层析系统，上海青浦沪西仪器厂；原子力显微镜XE-70，Park Systems（韩国）公司。

1.3 方法

1.3.1 PO酶的制备

按照试验组前期已取得的成果[6]，将经过分离纯化、浓缩，酶活约为731 U/mL、蛋白含量约为1.2 mg/mL的PO酶，作为此次试验用酶。

1.3.2 不同浓度的Ba2+处理PO酶

在试验中首先测定了Cl-对试验结果的影响，试验中用NaCl为阴性对照进行试验，结果表明Cl-浓度在1×10-7～1 mol/L范围内，Cl-对PO酶活性的影响在误差范围内，可以忽略，因此，可以忽略Cl-的干扰。

研究不同浓度的Ba2+对PO酶活性的影响。分别配制浓度为2，1，0.001和0.000 1 mol/L的氯化钡溶液，在室温下，分别与8 mL的PO酶混匀，作用30 min，使Ba2+（Ba2+）终浓度为0，100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7mol/L，经过上述处理的酶，为此次试验用酶。

1.3.3 PO酶活性的测定

将2.2 mL pH 6.8、0.067 mol/L的磷酸缓冲液和2.2 mL L-DOPA混匀，置于45 ℃的恒温水浴锅中，水浴2 min后，加入0.6 mL已经在45 ℃下预热2 min的1.3.2处理后的PO酶，将反应液立即倒入比色皿，选择紫外可见分光光度计动力学模块，在产物的最大吸收波长475 nm下测定反应液的吸光度变化，每隔5 s记录1次吸光度，测定8 min，选取反应体系吸光度为初速度区间数据计算酶活。一个酶活力单位（U）定义：单位体积酶液（mL）在单位时间（min）内使酶促反应体系吸光度增加0.001[7-8]，用U（或U/mL）表示，见公式（1）。

式中：ΔA为吸光度变化量；t为反应时间（min）；D为反应体系总体积（mL）/参加反应的酶液（mL）。

酶被Ba2+处理前后活性变化以相对酶活性表示，见公式（2）。

1.3.4 经不同浓度Ba2+处理的PO酶紫外光谱扫描

将浓度为10-5，10-4，10-2，10-1和0 mol/L的经Ba2+处理的PO酶进行紫外光谱测定，酶浓度进行适当稀释，符合紫外测定要求。使用紫外可见分光光度计测定Ba2+处理的PO酶的紫外图谱，扫描范围为200～400 nm，狭缝宽度为1.0 nm，以未处理的PO酶为对照。

1.3.5 经不同浓度Ba2+处理的PO酶内源荧光强度测定

利用荧光光度计测定经浓度为10-5，10-4，10-2，10-1和0 mol/L的Ba2+处理的PO酶的内源荧光。试验方法参照Liu等[9]方法加以修改。将经不同浓度Ba2+处理的PO酶液用磷酸缓冲液（0.067 mol/L，pH 7.2）进行稀释，使终浓度为0.08 mg/mL，选择发射波长λem=350 nm，检测PO酶的最大激发波长λex，然后在最大激发波长下选择发射波长范围。确定出的激发波长λex=288 nm，发射波长λem范围确定为200～600 nm，狭缝矫正均为5 nm。

1.3.6 经不同浓度Ba2+处理的PO酶红外光谱的测定

将经不同浓度Ba2+处理的PO酶冷冻干燥，取适量干燥的酶与适量KBr混合压片，使用FTIR光谱仪测定PO酶的红外光谱。在16 cm-1分辨率下，进行400～4 000 cm-1全波段扫描，扫描200次，每个样品检测3次，收集样品光谱。

参考前期相关研究[6]，采用Peak Fitv 4.12软件，选取酰胺Ⅲ带波段图谱进行基线调整、去卷曲、二阶求导和曲线拟合，多次拟合使残差（r2）大于0.99，根据各子峰的峰面积计算PO酶蛋白质二级结构含量[10-11]。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度Ba2+对PO酶活性的影响

不同浓度的Ba2+对酚氧化酶进行处理，待反应结束，对其酶活进行测定。当酚氧化酶相对活性等于100%时，说明Ba2+对酚氧化酶无作用；当酚氧化酶相对活性低于100%时，说明Ba2+对酚氧化酶活性具有抑制作用；当相对活性高于100%时，说明Ba2+对酚氧化酶具有激活作用。

如图1所示，随着Ba2+浓度的增加，PO酶的活性变化趋势为先上升后下降，当Ba2+浓度为10-7～10-5mol/L时，酚氧化酶活性上升较快；当Ba2+浓度为10-5mol/L时，相对酶活达到最大，即120.29%；当Ba2+浓度为10-4～10-3mol/L时，相对酶活开始下降，但酚氧化酶仍处于被激活状态；当Ba2+浓度为10-2～100mol/L时，酶活下降较快，Ba2+对酚氧化酶活性有抑制作用。因此，当Ba2+浓度较小时，其对酚氧化酶具有激活作用，这可能是因为Ba2+的电子云排布中具有空轨道，能与酶蛋白分子中的—NH3、—COOH、—OH和CO—NH—等形成配位键，能够对酶的活性中心结构有一定的维持作用；但当Ba2+浓度达到一定量后，其对酚氧化酶活性具有抑制作用，可能是过量的金属离子促进了酶蛋白的聚集作用，减少了底物与酶的结合，降低了酶促反应速率，从而降低了酶的活性。根据Ba2+处理后的酚氧化酶活性的测定，选取经Ba2+浓度0，1×10-5，1×10-4，1×10-2和1×10-1mol/L处理后的酶进行进一步研究。

图1 不同浓度Ba2+对PO酶活性的影响

2.2 Ba2+对PO酶结构的影响紫外光谱分析

如图2所示，PO酶在274±1 nm附近有特征性吸收峰，其原因主要是蛋白质肽链上的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基的芳香杂环π→π*跃迁引起的[12]。经0 mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度为0.26；经1×10-5mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度为0.322；经1×10-4mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度为0.362；经1×10-2mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度为0.326；经1×10-1mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度为0.302。随着Ba2+浓度的逐渐增大，吸光度呈先增大后减小的趋势，并未发生红移或蓝移现象。结合图1结果可以发现，当处理PO酶的Ba2+浓度为1×10-5和1×10-4mol/L时，PO酶处于激活状态，对应紫外光谱分析，此时PO酶的紫外吸光度是增加的，说明在这样的Ba2+浓度下，酶结构发生的变化是有利于酶与底物的结合，提高了酶的活性；当作用PO酶的Ba2+浓度为10-2和10-1mol/L时，PO酶的紫外吸光度低于对照组，可能是较高浓度的金属离子促进了酶蛋白的去折叠化，同时金属离子加速了蛋白分子间的聚集，结果使一部分暴露于水环境的Trp和Tyr残基又被包埋到疏水环境中。结合图1分析，这种改变降低了酶与底物的结合，从而降低了酶的催化活性。

图2 不同浓度Ba2+处理后的PO酶紫外吸收光谱变化

2.3 Ba2+对PO酶结构的影响内源荧光光谱分析

蛋白质中的芳香族氨基酸具有荧光特性，而且极易受环境影响，所以蛋白质荧光强度的变化可以间接反映出空间构象的变化[13]。用波长288 nm的激发光激发经不同浓度的Ba2+作用的PO酶，结果见图3。经不同浓度Ba2+处理的PO酶在波长337.8 nm处均出现了最高的发射峰。当Ba2+浓度为0 mol/L时，PO酶荧光强度为734.283；当Ba2+浓度为1×10-5mol/L，PO酶荧光强度上升至738.667；当Ba2+浓度为1×10-4mol/L时，PO酶荧光强度为757.609；当Ba2+浓度为1×10-2mol/L时，PO酶荧光强度开始减小，为702.352；当Ba2+浓度为1×10-1mol/L时，PO酶荧光强度为689.638。可以看出，随着与PO酶作用的Ba2+浓度的逐渐增加，PO酶荧光强度的变化趋势为先增大后减小，一般情况下，极性环境能影响蛋白质的生色团基团的基态和激发态能级，从而减少激发态的能量，使发射谱发生红移或蓝移现象[14]。从试验结果可以看出，经Ba2+处理，酚氧化酶的内源荧光光谱并未发生红移或蓝移的现象，这一结果与2.2紫外光谱分析结果相一致，所以，根据这2个光谱学的分析，可以推测Ba2+处理后的PO酶三级结构变化很小。

图3 不同浓度Ba2+处理后的PO酶荧光强度变化

2.4 Ba2+对PO酶结构的影响红外光谱分析

FTIR光谱仪在研究蛋白质和多肽二级结构中越来越重要，尤其对于检测非结晶态蛋白质二级结构非常重要[15]；在实际应用中，经常利用酰胺Ⅰ带和Ⅲ带来研究蛋白质的二级结构[16]，此次试验选取酰胺Ⅲ带（1 220～1 330 cm-1）波段图谱进行蛋白质结构分析。从图4（A）中可以看出，酚氧化酶在经过不同浓度的Ba2+处理后，在酰胺Ⅰ带1 650 cm-1附近的峰，发生的强度变化很小，峰位也未发生位移。酰胺Ⅲ带主要是C—N伸缩振动和N—H弯曲振动，Ba2+处理前后的PO酶在酰胺Ⅲ带特征峰的强度和峰型均有变化，见图4（B），对照组在1 300 cm-1和1 250 cm-1位置形成两个峰；1×10-5mol/L的Ba2+处理的PO酶的红外酰胺Ⅲ带特征峰的峰型与对照组基本一致，1 250 cm-1位置强度增加；1×10-4，1×10-2和1×10-1mol/L的Ba2+处理的PO酶在1 280 cm-1位置出现一个较明显峰，在1 242 cm-1处出现了一个峰，与对照比较，原来的1 300 cm-1和1 250 cm-1位置的峰的强度明显变小。酰胺Ⅲ带各子峰的归属：1 330～1 290 cm-1为α-螺旋，1 250～1 220 cm-1为β-折叠，1 295～1 265 cm-1为β-转角，1 270～ 1 245 cm-1为无规则卷曲[17-18]。结合图4（B）初步可以得出，Ba2+作用后PO酶的二级结构发生了变化。

图4 不同浓度Ba2+离子处理后的PO酶红外光谱图

采用Peak Fitv 4.12对分别经不同浓度Ba2+处理的PO酶红外光谱酰胺Ⅲ带进行基线调整、去卷曲、二阶求导、曲线拟合，经多次拟合使残差（r2）大于0.99，根据酰胺Ⅲ带各子峰归属二级结构类型，依据相应吸收峰面积百分比得出相应二级结构含量，结果见表1。从表1中可以看出，分别经不同浓度Ba2+处理的南美白对虾PO酶与未处理的PO酶相比，二级结构空间构象类型含量发生了变化，未处理的PO酶含有20.69%的α-螺旋，27.54%的β-折叠，22.52%的β-转角和29.25%的无规则卷曲。经1×10-5mol/L Ba2+处理的PO酶，α-螺旋和β-转角含量比对照组增加，无规则卷曲和β-折叠含量减少。经1×10-4mol/L Ba2+处理的PO酶，α-螺旋和无规则卷曲含量比对照组减少，β-转角和β-折叠含量比对照组增加，结合图1可以发现，经这2个浓度的Ba2+处理的PO酶活性是增加的。经1×10-2和1×10-1mol/L Ba2+处理的PO酶，α-螺旋、β-转角和β-折叠含量比对照组高，无规则卷曲含量比对照组低，结合图1可以发现，经这2个浓度的Ba2+处理的PO酶活性是降低的。在蛋白质中，α-螺旋和β-折叠一般不是酶的活性中心，也不是配体以及底物的结合中心，主要是稳定蛋白质空间结构的[17]，从表1中可以看出，经Ba2+处理的PO酶的α-螺旋和β-折叠均发生了变化，说明PO酶的空间构象发生了变化，趋向不稳定状态变化，结合图1结果，分别经10-5和10-4mol/L的Ba2+处理的PO酶活性是增加的，说明这种变化在最初的时候是有利于酶与底物的结合，对酶具有激活作用，其原因可能是适当浓度的金属离子的加入，使得酶与金属离子间发生水合作用，增加了酶与底物间的接触面积，增加了底物进入到酶活性中心的机会，所以酶活性增加。随着Ba2+浓度的增加，PO酶肽链上的侧链氨基酸展开，酶分子间容易发生聚集，活性中心被包埋，影响底物与酶之间的结合，最终导致酶活性降低。

表1 不同浓度Ba2+处理的酚氧化酶二级结构含量

3 结论

此次试验研究了Ba2+对南美白对虾酚氧化酶活性和结构的影响，随着Ba2+浓度的不断增加，酚氧化酶的活性呈先增加后减小的趋势。紫外光谱、荧光光谱研究表明，Ba2+使PO酶的紫外光谱和荧光光谱均发生了改变，但内源荧光光谱最大发射波长并未发生移动现象，说明Ba2+对PO酶三级结构影响比较小。红外光谱分析发现，Ba2+使PO酶的二级结构空间构象类型、含量均发生了变化，α-螺旋和β-折叠的变化可以说明PO酶的空间构象发生了变化，趋向不稳定状态变化，低浓度的Ba2+使PO酶发生的这种变化，对酶具有激活作用；随着Ba2+浓度的增加，PO酶活性开始降低。