食用动植物油脂中苯并(a)芘含量的快速测定

2020-12-01刘孝英王毅

食品工业 2020年11期

刘孝英，王毅

1. 四川文理学院康养产业学院（达州 635000）；2. 达州市食品药品检验所（达州 635000）

苯并(a)芘（BaP），化学式为C20H12，是一种五苯环芳香烃类化合物，常温下为无色至淡黄色针状晶体（纯品），性质稳定，沸点475 ℃，熔点179 ℃，不溶于水，微溶于乙醇、甲醇，溶于苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂中[1-4]。研究表明，BaP是强致癌物，微小剂量就能引起癌变，对人体细胞具有强烈致突变和致畸性[5-8]，世界多数国家加强对食品中BaP限量管理，相继出台许多关于BaP的强制性最低限量值标准，GB 2762—2017[9]规定油脂及其制品中BaP限值为10 μg/kg，欧盟限值为2 μg/kg[10]。苯并(a)芘在环境中存在广泛，来源主要有2个方面：一是工业生产和生活过程中煤炭、石油和天然气等燃料不完全燃烧产生的废气，包括汽车尾气、橡胶、沥青生产及吸烟产生的烟气等，它通过食物链在动植物体内中发生生物蓄积，造成食物污染[11-12]；二是食物在熏制、烘烤和煎炸过程中，脂肪、胆固醇、蛋白质和碳水化合物等在高温条件下会发生热裂解反应，经过环化和聚合反应就能够形成包括苯并(a)芘在内的多环芳烃类物质，尤其是当食品在烟熏和烘烤过程中发生焦糊现象时，苯并(a)芘的生成量将会比普通食物增加10～20倍[13-14]。油料高温蒸炒、油脂提取压榨、贮存运输均易产生或污染苯并(a)芘[15-16]。中国2018年食用植物油消费量为3 767万 t，占全球食用植物油消费量的18.8%，居世界第一。因此，建立精准有效的油脂中苯并(a)芘检测方法，对提高油脂质量，保护人类身体健康有着重要意义。通过比较分析，采用全自动固相萃取净化，避免手动加样萃取，接触有机试剂较少，对试验人员有较好保护，易于批处理，试验耗时较短，人为操作误差较小，适用于动植物油脂中苯并(a)芘含量的批量快速测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；GX274全自动固相萃取仪（吉而逊实验仪器（上海）有限公司）；12位固相萃取装置（上海安谱实验科技股份有限公司）；Milli-Q超纯水机（默克投资（中国）有限公司）；BS210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；Reeko Auto EVA-20 Plus全自动氮吹浓缩仪（深圳市锐科信息技术有限公司）。

苯并(a)芘标准品（GBW（E）080476中国计量科学研究院）；食用植物油、牛油、猪油（当地市场销售）；正己烷、二氯甲烷、乙腈（色谱纯）；苯并(a)芘分子印迹小柱（MIP-BAP，500 mg，6 mL，上海安谱实验科技股份有限公司）；中性氧化铝小柱（Alumina-N，500 mg，6 mL，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取

准确称取0.5 g试样于10 mL玻璃管中，加入5 mL正己烷，超声混合0.5 min，若不易溶，可50 ℃水浴加热溶解，待净化。

1.2.2 固相萃取

1.2.2.1 手动

将苯并(a)芘净化小柱置于12位固相萃取装置上，手动吸取试剂（二氯甲烷+正己烷）活化小柱、转移样液、淋洗除杂（正己烷）、收集净化液（二氯甲烷），将净化液在40 ℃下氮气吹干，准确吸取1 mL乙腈超声复溶0.5 min，经0.22 μm有机相微孔过滤膜过滤后待测。

1.2.2.2 自动

将待净化液和苯并(a)芘净化小柱置于全自动固相萃取仪上，按设定程序，活化小柱（5 mL二氯甲烷+5 mL正己烷）、转移样液、淋洗除杂（5 mL正己烷）、收集净化液（5 mL二氯甲烷），将净化液在40℃下氮气吹干，准确吸取1 mL乙腈超声复溶0.5 min，经0.22 μm有机相微孔过滤膜过滤后待测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱，CNW Athena PAHs（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；流动相，乙腈-水（90∶10）；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；荧光检测器：激发波长384 nm，发射波长406 nm。

1.2.4 标准溶液配制

准确吸取1.00 mL苯并(a)芘标准溶液（4.52 μg/mL），用乙腈定容至25 mL容量瓶，得到标准中间液（180.8 ng/mL），用乙腈稀释得到4.52，9.04，18.08，36.16，45.2和72.32 ng/mL的校准曲线溶液，临用现配。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱的选择

GB 5009.27—2016[17]中采用中性氧化铝小柱和分子印迹小柱，比较分析二者在测定食用油脂中苯并(a)芘含量上的区别，结果表明，同等条件下，使用中性氧化铝小柱净化样品的回收率低于使用分子印迹小柱净化样品的回收率，且RSD较高，所以分子印迹小柱具有更好的正确度和稳定性。

表1 2种萃取柱比较（n=7）

2.2 淋洗和洗脱溶剂的选择

参考有关研究[18]，选择正己烷为淋洗剂，5 mL正己烷基本能将固相萃取柱上油脂完全淋洗下来，比较分析乙腈和二氯甲烷对目标物质苯并(a)芘的洗脱效果，二者差异不显著，但是乙腈与正己烷不互溶，洗脱时需要加压操作，且乙腈耗量较大，后续氮吹浓缩耗时较长，稳定性也较差，所以选择二氯甲烷进行洗脱。二氯甲烷4 mL以上能够将目标物质苯并(a)芘完全洗脱，考虑稳定性，选择5 mL二氯甲烷进行洗脱。

2.3 萃取方式比较

使用分子印迹小柱，采用两种萃取方式进行加标回收试验，平行测定7次，回收率、RSD、溶剂耗量、耗时结果见表2。

表2 2种萃取方式比较（n=7）

与手动萃取方式相比，自动萃取方式回收率较高，RSD较低，具有更好的正确度和稳定性，且手动萃取方式操作人员必须时刻观察萃取流速，避免小柱干燥，费时费工，尤其是批量处理样品时容易出现加液差错，而自动萃取方式按照设定程序进行，流速可控，时间一致，有机试剂耗量更低，试验耗时更短，人为操作误差较小，接触有机试剂少，既有利于保护试验操作人员健康，又有利于大批量样品快速检测。

2.4 线性及校准

吸取苯并(a)芘标准溶液10 μL，高效液相色谱-荧光检测器检测，校准曲线见图1，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，得到回归方程：y=92 735.5x+28 854，R2=0.999 8，苯并(a)芘在4.52～72.32 ng/mL之间线性关系良好。

图1 校准曲线

2.5 检出限和定量限

根据GB/T 32465—2015[19]和GB/T 27417—2017[20]，检出限的计算和表达方法较多，试验采用信噪比法结合逐步稀释法，将标准溶液逐步稀释至S/N=3时的浓度即为检出限浓度，S/N=10时为定量限，经过稀释测定，0.090 4 ng/mL标准溶液的S/N值见表3。

从表3可以计算出当S/N=3时标准溶液浓度约为0.065 ng/mL。

检出限=检出限浓度×定容体积/取样量=0.065（ng/mL）×1.00（mL）/0.5（g）=0.13 μg/kg （1）

定量限=0.13×10/3=0.43 μg/kg （2）

检出限低于GB 5009.27—2016中规定的检出限0.2 μ g/kg和定量限0.5 μg/kg。

表3 0.090 4 ng/mL标准溶液的S/N值（n=7）

2.6 回收率和精密度

采用空白食用油样品进行加标回收率试验，添加3个不同体积的标准溶液，相当于样品含量9.04，18.08和36.16 μg/kg，在1.2的自动萃取条件下测定，每个加标浓度样品平行测定7次，结果显示，3个不同加标梯度下的平均回收率分别为97.1%，98.3%和99.3%，相对标准偏差（RSD）分别为2.1%，1.4%和1.5%，方法的正确度和精密度满足化学分析要求。

2.7 市售样品测定

采集当地市售的50个食用动植物油脂样品，包括调和油、大豆油、花生油、菜籽油、玉米胚芽油、葵花籽油、橄榄油、芝麻油、花椒油、牛油、猪油等样品，按1.2的自动萃取方法制备样品溶液，液相色谱-荧光检测器检测，计算含量，其中6批样品未检出苯并(a)芘，42批样品检出苯并(a)芘但含量低于3.0 μ g/kg，2批样品检出含量超过10 μ g/kg（分别为11.3和14.6 μg/kg）。苯并(a)芘标准溶液及实际样品的色谱图见图3，苯并(a)芘标准溶液出峰时间在7.7 min左右。