鸡蛋腐乳发酵工艺优化及品质评价

沙菲，王泽琳，吉艳莉，李瑞英，仝其根，王丽英，郭慧园

（1.中国食品科学技术学会，北京100048；2.北京农学院，北京102206；3.蛋品安全生产与加工北京市工程研究中心，北京100094；4.北京王致和集团公司，北京100049；5.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

鸡蛋富含蛋白质、维生素和矿物质等，营养价值丰富。鸡蛋腐乳是一种全蛋发酵制品，制作方法类似传统大豆腐乳，是以鸡蛋为原材料，经过霉菌发酵，使用红曲和面曲后期发酵制成的一种全新调味食品。发酵过程中，将鸡蛋中的蛋白大分子分解成氨基酸和肽等小分子营养成分，更易于人体吸收[1]。

我国生产腐乳常用菌主要是毛霉属与根霉属[2]。毛霉属又包含腐乳毛霉（Mucor sufu）、五通桥毛霉（Mucor wutungkiao）、雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）和总状毛霉（Mucor racemosus）[3]。其中，腐乳毛霉的菌丝细密粗壮[4]、菌丛高大，菌丝为白色，菌丝皮膜柔软细腻[5]。总状毛霉的菌丝较长、菌丛厚密，菌丝为灰色或灰褐色[6]。五通桥毛霉菌丝茂盛、菌落生长速度快，菌丝呈白色[7]。雅致放射毛霉的菌落生长迅速，质地呈疏松絮状，菌丝幼时呈白色，老熟后逐渐变成浅灰色[8]。根霉属包含米根霉（Rhizopus oryzae）和少根根霉（Rhizopusarrhizus）[9]。其中，米根霉的菌丝呈匍匐状，孢子囊呈椭圆形，中轴基发达，孢子大小不一，表面有纹，糖化能力和产生乳酸能力都很强[10]。少根根霉的菌落生长较快，呈絮状，菌落表面有大量细密的孢囊头[11]，产糖化酶和乳酸能力比较强。

目前，对于鸡蛋腐乳的研究鲜有报道。李双峰[12]将鸡蛋煮熟去皮或者制成鸡蛋干，撒上面粉，制作白坯，喷洒毛霉菌液进行有氧培养，培养30 h～60 h后，将长满的毛霉菌丝搓平在各自的白坯上得到毛霉坯，将毛霉坯使用调味料腌制后装入密封罐内，将红曲和面曲使用酒液浸泡、磨碎后加入调味辅料制备卤汤，将卤汤倒入密封罐内，密封发酵7 d以上制成鸡蛋发酵食品。除此之外未见有关霉菌类发酵蛋制品研究的报道。

本研究采用正交试验，筛选鸡蛋腐乳的最佳前期发酵菌种、碳源及添加量、磷酸二氢钾的添加量，研究3种后期发酵汤汁对鸡蛋腐乳后期发酵品质的影响。试验以孢子数、前期发酵菌种形态评价、总酸、氨基酸态氮、感官评价、质构及流变频率扫描分析为评价指标，探寻鸡蛋腐乳的最佳制作条件，以期为鸡蛋腐乳的工业化生产提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋、红酒、黄酒、白酒、酒糟、食盐、五香粉、白砂糖：市售；红曲、面曲、红方汤汁（主要成分为红曲米膏、黄酒、白酒、面曲、白砂糖）、腐乳毛霉（编号FM）：北京王致和食品集团有限公司；米根霉（Rhizopus oryzae，编号 M4）、总状毛霉（Mucor racemosus，编号 Z4）、少根根霉（Rhizopus arrhizus，编号 S3）、五通桥毛霉（Mucor wutungkiao，编号 W4）、雅致放射毛霉（Actinomucor elegans，编号Y3）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

D-麦芽糖（食品级）、糊精（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；D-果糖（食品级）：北京畅华试剂有限公司；亚硫酸氢钠（食品级）：北京世纪红星化工有限责任公司；谷氨酰胺转氨酶（glutamine transaminase，TG-M）（酶活 20 U/g，食品级）：江苏一鸣精细化工有限公司；氢氧化钠（分析纯）、葡萄糖（优级纯）、氯化钠（优级纯，99.8%）：北京化工厂；甲醛（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）：西陇化工股份有限公司；麦芽浸粉琼脂（malt extract agar，MEA）（生物试剂）、马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）（生物试剂）：北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

EYEL4旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；JMB6002电子天平：余姚市纪铭称重校验设备有限公司；HH-S数显恒温水浴锅、85-2恒温磁力搅拌器：常州翔天实验仪器厂；MJ-25BM04B美的搅拌机：广东美的精品电器制造有限公司；PHB-4便携式pH计：上海精密科学仪器有限公司；QZK28-A02高档嵌入式蒸汽烤箱：佛山市雷哲电器有限公司；DL-CJ-1N型超级洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；CX21显微镜：奥林巴斯（中国）有限公司；DSHZ-300A水浴恒温振荡器：太仓市实验设备厂；HZS-H漩涡式振荡器：北京东联哈尔仪器制造有限公司；TMS Pro质构分析仪：美国Food Technology Corporation公司；AR1500 TA Instruments流变分析仪：英国TA仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种悬浮液的制备

将冻干菌种溶于无菌生理盐水中，采用稀释涂布法接种于PDA或MEA的平板培养基中，置于28℃恒温培养箱中活化2 d～3 d。待培养皿上长出单菌落，用接种环挑取生长速度快、菌丝丰满的单菌落，接种于试管斜面上，培养2 d～3 d，重复培养数次，当斜面菌丝生长茂盛、颜色均一时，即可进行菌种悬浮液的配制。将生长茂盛的菌丝，挑至无菌生理盐水中，旋涡振荡2 min，采用梯度稀释法，通过显微镜测定菌液的孢子数，将其稀释至106个/mL，即为前期发酵所需的菌种悬浮液。

1.3.2 后期发酵汤汁的制备

1.3.2.1 红方腐乳汤汁

使用北京王致和食品集团有限公司提供的大块红方腐乳汤汁。

1.3.2.2 红酒汤汁

将1 kg红曲和4 kg面曲用粉碎机研磨成粉状，5 kg酒糟用榨汁机榨成匀浆备用。将一定量的红酒、黄酒、白酒与红曲、面曲、酒糟混合均匀，酒精度控制在15°～16°，加入质量分数8%的食盐。将混合均匀的汤汁在电磁炉上煮制微沸状态，保持15 min，自然条件下晾凉，即为红酒汤汁[13]。

1.3.2.3 五香汤汁

将5 kg面曲用粉碎机研磨成粉状备用。将一定量的五香粉、黄酒、白酒、砂糖与面曲混合均匀，酒精度控制在15°～16°，加入质量分数8%的食盐。将混合均匀的汤汁在电磁炉上煮制微沸状态保持15 min，冷却到25℃，即为五香汤汁。

1.3.3 鸡蛋腐乳工艺流程

参考大豆腐乳的制作工艺，结合鸡蛋的加工特性稍作改动[3，13]。利用搅拌机在5 000 r/min下将全蛋液均匀打散，再将蛋液用30目不锈钢过滤网过滤，以滤去卵黄系带，依据前期试验结果，加入质量分数0.05%的亚硫酸氢钠以保持蛋液的颜色，质量分数0.2%的谷氨酰胺转氨酶（TG-M）以增强蛋白质分子间的作用力，质量分数4%、8%的不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、果糖、糊精），质量分数0.1%、0.3%的磷酸二氢钾，搅拌均匀，45℃水浴30 min，旋转蒸发仪45℃旋蒸10 min以去除气泡，80℃蒸汽烤箱蒸40 min，冷却至25℃。将蛋坯切成2.5 cm×2.5 cm×1.6 cm的小块，表面均匀蘸取初始孢子数为 1×106个/mL 的不同菌液（Z4、S3、W4、Y3、FM、M4），在温度为 28℃，湿度为 90%的条件下，前期发酵2 d后搓毛，浸入盐水中腌制7 d（咸蛋坯的氯化钠含量为14%），腌制结束后取出，每8块装在1个密封的玻璃瓶中，灌满后期发酵汤汁，在25℃下后期发酵 2、4、6、8、10 周。

1.3.4 鸡蛋腐乳前期发酵工艺优化

采用L24（61×41×23）正交试验，探究菌种、碳源和磷酸盐对鸡蛋腐乳前期发酵品质的影响，筛选出最适前期发酵菌种，每种样品做3个平行，结果取平均值。因素水平见表1。

表1 前期发酵L24（61×41×23）正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels for L24（61×41×23）of orthogonal test the pre-fermentation

1.3.5 孢子数的测定

根据SB/T 10315-1999《孢子数测定法》测定[14]。

1.3.6 前期发酵菌种形态评价

前期发酵菌种形态评价方法参考罗晓妙等[15]的评价方法，并稍作改动。选用10位感官分析人员组成评价小组进行感官评价，其中男女各占一半，且均有超过60 h的感官评定经验。对前期发酵2 d蛋坯的菌丝色泽、气味、质地和菌落形态进行评价，每个指标满分为5分，总分20分，具体评分标准见表2。

表2 前期发酵菌种形态评分表Table 2 The table of pre-fermentation morphological score

1.3.7 总酸的测定

采用SB/T 10170-2007《腐乳》的总酸检测方法[16]。

1.3.8 氨基酸态氮的测定

采用SB/T 10170-2007《腐乳》的氨基酸态氮的检测方法[16]。

1.3.9 感官评价的测定

参考大豆腐乳的感官要求[16]，并结合鸡蛋腐乳的特性，略作修改。选取10位有经验的感官评价员，分别从色泽、块型、香气、滋味、口感5个方面进行评分。具体评分方法见表3。

1.3.10 质构的测定

选取块型整齐、均匀的鸡蛋腐乳，除去汤汁和蛋腐乳的外表皮，从中心部位切取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的样品，放置于质构仪操作台的中央部位，采用二次下压法测定蛋腐乳的质构曲线[17]。测定参数：探头型号：TA-AACC36圆盘挤压探头；探头直径：20 mm；压缩距离：7.5 mm；压缩速度：24 mm/min。

表3 鸡蛋腐乳后期发酵感官评价表Table 3 Table of egg pickled tofu during post-fermentation sensory evaluation

1.3.11 流变频率扫描

选择直径20 mm的不锈钢探头，除去蛋腐乳的汤汁及外表皮，放置于流变仪的平板上，进行频率扫描。参数设定[18]为振荡频率范围：0.01 Hz～100 Hz；测定温度：25℃；应变控制在0.1%（通过预试验获得线性黏弹性范围）；样品厚度：1.5 mm。

1.4 数据处理

使用SPSS和OriginPro 8进行试验设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验

2.1.1 正交试验设计与结果

根据孢子数和前期发酵菌种形态评价的指标测定，鸡蛋腐乳前期发酵的正交试验结果见表4。

表4 正交试验结果Table 4 Orthogonal test results

2.1.2 正交试验的结果分析

根据表4的正交试验结果，对孢子数和前期发酵菌种形态评价的结果进行极差分析和方差分析，结果见表5～表8。

表5 孢子数的极差分析Table 5 Range analysis of spore number

由表5可知，5个因素对孢子数的影响主次为：菌种（A）＞碳源（B）＞碳源添加量（C）＞磷酸二氢钾（D）＞空列（E）。在试验范围内，得到的最佳条件为A2B1/3C1D2，即添加4%的葡萄糖或果糖，0.3%的磷酸二氢钾，使用少根根霉作为前期发酵菌种。霉菌发酵孢子数的方差分析见表6。

表6 孢子数的方差分析Table 6 Variance analysis of spore number

由表6可知，菌种的改变对孢子数的影响极显著（P＜0.01），碳源、碳源添加量、磷酸二氢钾的改变对孢子数的影响不显著（P＞0.05）。

形态评价的极差分析见表7。

表7 形态评价的极差分析Table 7 Range analysis of morphological evaluation

由表7可知，5个因素对前期发酵菌种形态评价的影响主次为：菌种（A）＞碳源（B）＞碳源添加量（C）＞磷酸二氢钾（D）＞空列（E）。在试验范围内，得到的最佳条件为A6B3C2D1，即添加8%的果糖，0.1%的磷酸二氢钾，使用米根霉作为前期发酵菌种为最佳。形态评价的方差分析见表8。

由表8可知，菌种的改变对前期发酵菌种形态评价的影响极显著（P＜0.01），碳源、碳源添加量、磷酸二氢钾的改变对前期发酵菌种形态评价的影响不显著（P＞0.05）。

对孢子数和前期发酵菌种形态评价2项指标综合分析可见，前期发酵菌种的改变对鸡蛋腐乳前期发酵品质的影响极显著（P＜0.01）。所以，筛选出适合鸡蛋腐乳前期发酵的菌种尤为重要。试验结果表明，鸡蛋腐乳前期发酵2 d，使用少根根霉前期发酵得到的孢子数最多，使用米根霉前期发酵的菌种形态评价得分最高。综合比较，使用少根根霉虽然孢子数多但是孢子偏小，且在前期发酵后期菌丝发黑，会影响鸡蛋腐乳最终的感官评价，而米根霉的整体评分较好，因此，选择米根霉为下一步的试验用菌。其次，鸡蛋中的碳源较为欠缺[19-20]，碳源是保证菌株正常生长的必要条件，在菌株生长初期，若没有充足的营养物质，会直接影响菌株的正常生长，容易被杂菌污染，影响鸡蛋腐乳的品质。结合2项指标综合分析，选择果糖为鸡蛋腐乳的碳源。即添加8%的果糖，而0.1%的磷酸二氢钾对米根霉前期发酵更有利。利用A6B3C2D1进行验证试验，综合菌种形态评分19.0分，米根霉的孢子数为6.12×107个/mL。

表8 形态评价的方差分析Table 8 Variance analysis of morphological evaluation

2.2 汤汁对鸡蛋腐乳品质的影响

以总酸、氨基酸态氮、感官评价、质构和流变频率扫描为指标，考察3种后期发酵汤汁（红方腐乳汤汁、红酒汤汁、五香汤汁）对鸡蛋腐乳品质的影响。试验结果见图1～图5。

由图1和图2，从总酸的结果看，使用红酒汤汁的总体数值偏高，使用五香汤汁的总体数值偏低；从氨基酸态氮的结果看，使用红方腐乳汤汁的总体数值偏高，使用五香汤汁的总体数值偏低。综合2个指标的结果，使用红方腐乳汤汁作为后期发酵汤汁的效果最优。分析原因可能是，红方腐乳汤汁主要含有红曲，红曲是以籼米为原材料，经过红曲霉发酵而成，红曲可以加快腐乳的后期发酵[21]。红酒汤汁由于含有大量有机酸，本身总酸含量较高，因此会影响鸡蛋腐乳的理化指标结果。五香汤汁对鸡蛋腐乳的发酵程度无显著影响。发酵第8周时总酸和氨基酸含量发生了较大的变化，是因为酶解达到了较高的水平，这时鸡蛋腐乳的理化指标最优，总酸为0.525 g/100 g，氨基酸态氮为0.357 g/100 g。

图1 总酸的试验结果Fig.1 The results of fructose content

图3 感官评价的试验结果Fig.3 The results of fructose content

由图3可知，以色泽为评价指标，使用红方腐乳汤汁，鸡蛋腐乳表面颜色均匀一致，断面呈均匀的黄色；使用红酒和五香汤汁，鸡蛋腐乳表面颜色不均。以块型为评价指标，使用红方腐乳汤汁和红酒汤汁，鸡蛋腐乳的块型比较整齐，不破皮、不缺角、不易碎；使用五香汤汁，鸡蛋腐乳会发生破皮、缺角的现象。以香气为评价指标，使用红方汤汁，鸡蛋腐乳的香气纯正，有酒香味，无不良香气；使用红酒和五香汤汁，鸡蛋腐乳的香气评分较低。以滋味为评价指标，使用红方汤汁，鸡蛋腐乳滋味鲜美，有蛋香味，咸淡适中；使用红酒和五香汤汁，鸡蛋腐乳的滋味评分较低。以口感为评价指标，使用3种汤汁，鸡蛋腐乳的口感均比较细腻，无颗粒感、软硬适中。感官评价5项指标的综合分析显示，使用红方腐乳汤汁制作的鸡蛋腐乳的感官评价的分值整体偏高，可能由于红方腐乳汤汁中红曲所占比例较大，而红曲是经红曲霉发酵制得，其中含有一定的活性成分，可以使鸡蛋腐乳更好地进行后期发酵。并且，红方腐乳汤汁是特有汤汁，其质地均一，比例协调，香气浓郁，可以在一定程度上掩盖鸡蛋的腥味，改善鸡蛋腐乳的风味。因此，使用红方腐乳汤汁制作的鸡蛋腐乳的感官品质最优，总分为86.9分。

图4 质构的试验结果Fig.4 The results of fructose content

由图4可知，以硬度为指标，使用3种汤汁，随后期发酵时间的延长，鸡蛋腐乳的硬度均呈下降趋势，且差异不显著。鸡蛋腐乳硬度下降是由于在前期发酵基础上，后期发酵过程中，蛋白质继续分解，其网状结构被破坏，使硬度下降。以弹性为指标，使用3种汤汁，随后期发酵时间的延长，鸡蛋腐乳的弹性均呈下降趋势，且后期发酵10周均下降到同一水平，这一现象说明，8周～10周后，酶解对蛋坯硬度的影响达到了一个拐点，使硬度下降较快。以黏性为指标，使用3种汤汁，随后期发酵时间的延长，鸡蛋腐乳的黏性均呈上升趋势，使用红酒汤汁制作的鸡蛋腐乳的黏性上升最快。鸡蛋腐乳在后期发酵过程中，蛋白质的水解，将大分子分解为小分子，大分子降解的过程是游离物质增多的过程[22-24]，使网络结构更加均匀、细致，致使鸡蛋腐乳的硬度下降，弹性减小，黏性增加。

图5 流变频率扫描的试验结果Fig.5 The results of fructose content

由图5可知，随鸡蛋腐乳后期发酵时间的延长，使用红方腐乳汤汁，鸡蛋腐乳的弹性模量呈逐渐上升的趋势；使用红酒汤汁，鸡蛋腐乳的弹性模量呈先上升后下降再上升的过程；使用五香汤汁，鸡蛋腐乳的弹性模量呈缓慢上升的趋势。说明随着剪切频率的增加，蛋白质的网状结构可以重新组合产生新的蛋白质凝胶结构，在高剪切速度下的固体颗粒分子具有更快的流动性[25]，因此随着剪切频率的增加，其弹性模量呈上升趋势。综合来看，使用3种汤汁，鸡蛋腐乳的弹性模量均在后期发酵10周时达到最大。因此，可以推测影响鸡蛋腐乳流变性质变化的主要因素为前期发酵菌种，而后期发酵汤汁的改变对其影响不大。且弹性模量和硬度值相一致，说明10周后的蛋腐乳成熟度高，达到了食用的程度。

3 结论

对正交试验的结果进行综合分析认为，使用米根霉为前期发酵菌种，在全蛋液中添加质量分数8%的果糖和0.1%的磷酸二氢钾制作的鸡蛋腐乳前期发酵品质最优，以此条件进行验证得到米根霉的孢子数6.12×107个/mL，菌种形态评价得19.0分。利用红方汤汁、红酒汤汁、五香汤汁对米根霉发酵的蛋坯进行后发酵，其结果是红方腐乳汤汁最优，后期发酵8周蛋腐乳中的总酸含量为0.525 g/100 g、氨基酸态氮含量为0.357 g/100 g，感官评价总分为86.9分。通过对鸡蛋腐乳的品质评价，发现前期发酵菌种主要影响其口感、硬度和弹性，后期发酵汤汁主要影响其理化指标、色泽、香气和滋味。因此，在后续的研究中可以通过改善后期发酵汤汁来提高鸡蛋腐乳的风味。本文优化了鸡蛋腐乳的前期发酵条件，使前期发酵更加充分，为改善鸡蛋腐乳的风味打下良好基础。