响应面法优化超声辅助提取大果青扦叶总黄酮及其抗氧化性研究

李艳艳，王俊青，刘王文，陈壮，王晓欢

（1.平顶山学院，河南平顶山467000；2.平顶山市药用植物功能成分利用工程技术研究中心，河南平顶山467000；3.河南省伏牛山区濒危植物繁育工程技术研究中心，河南平顶山467000）

大 果 青 扦 （Picea neoveitchii） 隶 属 于 松 科（Pinaceae）云杉属（Picea）植物，国家二级保护植物，为我国特有珍稀濒危植物，与青扦（Picea wilsonii）相比，叶片形态差异明显，大果青扦果实也相对较大。大果青扦主要分布在湖北西部、陕西秦岭和甘肃天水及白龙江流域，是集用材、药用、观赏和生态于一体的优良植物[1-2]。国内外学者分析大果青扦的表达序列标签-简单重复序列标记[3]，叶绿体基因组序列[4]，大果青扦、秦岭冷杉和太白红杉的生存环境影响因子[5]，种子的萌发及种群的动态特征分析[1]以及其含有的黄酮及黄酮的结构与抗菌活性、细胞毒性[6]等进行了研究。Chen等[6]从大果青扦枝叶里分离出来8种化合物，其中C-甲基化的云杉黄酮苷，有抗真菌活性、细胞毒性等作用。随后又在云杉属叶片黄酮、多酚含量以及抗氧化性有研究报道[7-9]，黄酮类物质具有保肝、抗衰老、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、治疗心血管系统疾病等作用[10-16]，但对大果青扦叶中黄酮提取工艺及抗氧化活性研究鲜见报道。超声波辅助提取是利用超声波具有的机械效应、空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分。超声辅助提取黄酮类化合物，操作简单、成本低、时间短、提取率高，目前应用较多。本研究通过单因素试验和响应面分析法，优化筛选超声辅助提取大果青扦叶总黄酮的最优提取工艺并对其DPPH自由基，ABTS+自由基和亚硝酸盐的清除能力进行研究，以期为大果青扦叶黄酮资源的利用和开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

大果青扦叶取自湖北襄阳，将其置于50℃的电热鼓风干燥箱中烘4 d后，经粉碎机粉碎过60目筛网留以备用。

1.2 试剂与仪器

芦丁标准品、二苯基苦基肼自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海源叶生物科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]：天津光复精细化工研究所；三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸（vitamin C，VC）、无水乙醇、亚硝酸钠、六水三氯化铝、氢氧化钠、过硫酸钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

DR6000紫外可见分光光度计：哈希（上海）仪器有限公司；H2050R高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Q20真空旋转蒸发仪：郑州长科工贸有限公司；101-1-BS电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；KQ-200VDE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 芦丁标准曲线的绘制

参照李柏和王俊青等[17-18]的方法稍加改进，配置成2 mg/mL芦丁标准溶液为横坐标（X）在波长506 nm处测定其吸光度A值，以吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。标准曲线方程为：Y=0.334 5X+0.023，R2=0.999。

1.4 提取工艺

精密称取2.0 g的大果青扦粉末，按一定液料比、乙醇浓度、超声功率、提取温度、超声时间、提取次数，用薄膜包封超声辅助提取，将其溶液摇匀，进行离心，离心速度为4 000 r/min，离心25 min，再取上清液定容，然后加入同等浓度乙醇并定容至刻度线，摇匀。后续操作按照1.3中的步骤，取样加显色剂，平行测定数值3次。

总黄酮提取率的计算公式：

式中：E为总黄酮提取率，mg/g；c为根据标准曲线回归方程求出的黄酮质量浓度，mg/mL；n为提取液的稀释倍数；v为离心液定容的体积，mL；m为样品质量，g。

1.5 响应面优化提取工艺

通过单因素的试验结果可以看出液料比和提取次数对于总黄酮提取率的影响因素较少，所以确定液料比 40 ∶1（mL/g），提取次数 2 次，采用 Design-Ex－pert8.0.6软件（Stat-EaseInc，USA），选择乙醇浓度、提取温度、超声功率和超声时间4个影响因素，根据表1的响应面Box-Benhnken设计因素与水平，优化大果青扦叶总黄酮的超声辅助提取工艺。

表1 响应面分析法因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface methodology

1.6 体外抗氧化研究

1.6.1 DPPH自由基清除作用

参照杨永涛[19]的方法配制出各个梯度的样品溶液进行自由基清除。取样品溶液2mL和DPPH溶液2mL，摇匀混合，静置反应30 min后，以无水乙醇调零，在517 nm波长处测定吸光度记为A0；再取无水乙醇2 mL和DPPH溶液2 mL，摇匀混合，静置反应30 min后，以无水乙醇调零，在517 nm波长处测定吸光度记为A1；再取样品溶液2 mL和无水乙醇2 mL，摇匀混合，静置反应30 min后，以无水乙醇调零，在517 nm波长处测定吸光度记为A2；以抗坏血酸（VC）溶液作阳性对照。采用公式 DPPH 自由基清除率/%={[A2-（A1-A0）]/A2}×100，计算DPPH自由基的清除率。

1.6.2 ABTS+自由基的清除作用

取ABTS溶液（7 mmol/L）、过硫酸钾溶液各20 mL，按照1∶1体积比混合均匀，避光放置12 h后留做混合液。取混合液，在734 nm处测量吸光度。然后用无水乙醇调节吸光度为0.70±0.02，ABTS工作液配制完成（ABTS工作液需现配现用）。取0.4 mL样品溶液，加入ABTS工作液4.0 mL，静置反应5 min，以无水乙醇调零，在734 nm处测得吸光度A1。再取0.4 mL蒸馏水，加入ABTS+自由基工作液4.0 mL，静置反应5 min，以无水乙醇调零，在734 nm处测得吸光度A0。以抗坏血酸（VC）溶液作为阳性对照，采用公式ABTS+自由基清除率/%=[（A0-A1）/A0]×100，计算ABTS+自由基的清除效果。

1.6.3 亚硝酸盐的清除作用

根据张灵帮等[20]的方法再稍加改进，于波长538 nm处测定其吸光值记为A1，以蒸馏水作为空白组，测得吸光值记为A2，没有加入盐酸萘乙二胺溶液测定的吸光值记为A0。以抗坏血酸（VC）溶液作为阳性对照，采用公式亚硝酸盐清除率/%=[A2-（A1-A0）]/A2×100，计算亚硝酸盐清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对总黄酮提取率的影响

液料比对总黄酮提取率的影响见图1。

图1 液料比对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction of total flavonoids

分别采用液料比为 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50∶1（mL/g）进行超声辅助提取，设定提取温度45℃、超声功率320 W、超声时间30 min、乙醇浓度50%、提取次数为1次，测定黄酮的提取率。如图1所示，增加乙醇用量，总黄酮提取率随着升高；当液料比达到40∶1（mL/g）时，提取率为8.35%；继续增加乙醇溶液的用量，黄酮的提取率变化不明显，这可能是随着溶剂的增加，导致其他杂质也被提取出来，从而使黄酮的溶解度降低，提取率减少[21]。故后续响应面分析法试验均采用最佳液料比为 40 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取温度对总黄酮提取率的影响

提取温度对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extractive temperature on extraction of total flavonoids

分别采用提取温度 35、45、55、65、75 ℃ 进行超声提取，设定超声功率320 W、超声时间30 min、液料比40 ∶1（mL/g）、乙醇浓度 50%、提取次数为 1 次，测定黄酮的提取率。由图2所示，提取温度逐渐升高，总黄酮提取率得到了大幅度提升，提取温度45℃～55℃之间，总黄酮提取率增加缓慢，在55℃时提取率达到最大；继续升高提取温度，使黄酮部分结构被破坏，从而使提取率降低[22]。所以总黄酮提取时最佳提取温度为55℃。

2.1.3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对总黄酮的提取率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对总黄酮的提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of total flavonoids

分别采用乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%进行超声辅助提取，设定提取温度45℃、超声功率 320 W、超声时间 30 min、液料比 40 ∶1（mL/g）、提取次数为1次，测定黄酮的提取率。由图3结果可知，当乙醇浓度为50%时，提取率为8.05%，达到最高。所以总黄酮提取时最佳乙醇浓度为50%。

2.1.4 超声时间对总黄酮提取率的影响

超声时间对总黄酮提取率的影响见图4。

图4 超声时间对总黄酮的提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction of total flavonoids

分别采用超声时间为 20、40、60、80、100、120 min进行超声辅助提取，设定提取温度45℃、超声功率320 W、液料比 40∶1（mL/g）、乙醇浓度 50%、提取次数为1次，测定黄酮的提取率。由图4结果可知，当超声时间为60 min时，提取率达到10.28%，达到最大。超过60 min，黄酮的结构可能随着超声时间的延长而遭到氧化破坏，从而使总黄酮提取率降低[22]，所以总黄酮提取时最佳超声时间为60 min。

2.1.5 超声功率对总黄酮提取率的影响

超声功率对总黄酮的提取率的影响见图5。

图5 超声功率对总黄酮的提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction of total flavonoids

分别采用超声功率为240、320、400、480、560 W进行超声辅助提取，设定提取温度45℃、超声时间30 min、液料比 40 ∶1（mL/g）、乙醇浓度 50%、提取次数为1次，测定总黄酮的提取率。如图5所示，超声功率为480 W时，总黄酮的提取率为9.91%，达到最大。而超声功率再增大时，过大的超声功率造成黄酮结构被破坏，从而使总黄酮的提取率降低[23]，所以总黄酮提取时最佳超声功率为480 W。

2.1.6 提取次数对总黄酮提取率的影响

提取次数对总黄酮的提取率的影响见图6。

图6 提取次数对总黄酮的提取率的影响Fig.6 Effect of extraction times on extraction of total flavonoids

分别采用1、2、3次进行超声辅助提取，设定提取温度55℃、超声功率320 W、超声时间30 min、液料比40∶1（mL/g）、乙醇浓度50%，测定总黄酮的提取率。如图6所示，在提取次数为2次时，提取率为9.53%，提取率达到最大。提取次数过多，耗时较长，且浪费试剂，故后续响应面分析法均采用超声辅助提取2次。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面分析

通过单因素试验结果，确定响应面法试验设计的因素和水平，即选取4个因素，根据Box-Benhnken中心组合设计原理[24-25]，试验设计方案和结果见表2。

表2 响应面设计方案与结果Table 2 The program and experimental results of response surface methodology

续表2 响应面设计方案与结果Contimue table 2 The program and experimental results of response surface methodology

以各因素为自变量，利用软件DPS8.06进行结果分析。以总提取率为指标进行二次多项式逐步回归分析，得到的总黄酮提取率（Y）对A、B、C、D回归数学模型为：Y=12.04+0.16A-0.098B-0.31C+0.048D-0.048AB+0.077AC+0.12AD-0.32BC+0.22BD-0.072CD-0.52A2-0.28B2-0.46C2-0.87D2。

对上述模型进行方差分析，见表3。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

续表3 回归方程方差分析表Contimue table 3 Variance analysis of mathematical regression model

模型F值为10.47意味着模型具有重要意义。模型P＜0.000 1，回归方程具有显著性，可以对试验结果进行分析，并进一步对回归方程各项做显著性检验。其中，提取温度（C），超声时间的二次项（A2），提取温度的二次项（C2），乙醇浓度的二次项（D2）的P值均小于0.01，表明对总黄酮提取率影响极显著；超声时间（A），超声功率和提取温度的交互项（BC），超声功率的二次项（B2）均大于0.01小于0.05，表明对总黄酮提取率影响显著。模型失拟项P＞0.05，表明模型误差小。在所选因素结果中的影响排序：提取温度＞超声时间＞超声功率＞乙醇浓度。

利用响应面曲面图来反映各因素之间的两两交互对大果青扦叶黄酮提取率的影响，图7为四因素交互作用的响应面图。响应值受曲线走势影响，即越陡的曲线走势，对总黄酮的提取率影响越大；越平滑的的曲线走势，对总黄酮提取率的影响越小[26]。乙醇浓度和提取温度对总黄酮提取率的影响较大，因为其曲线趋势较陡；超声功率和超声时间对其影响较小，因为其曲线走势较平缓。

图7 四因素交互作用对大果青扦叶总黄酮提取率的影响Fig.7 Effects of interaction between four factors on total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

2.2.2 验证试验

根据试验条件，经软件分析得最优工艺条件是：超声时间62.56 min，超声功率481.98 W，提取温度51.67℃，乙醇浓度50.63%，提取率可达12.10%。结合实际应用，各工艺条件可调整为超声时间63 min，超声功率480 W，提取温度52℃，乙醇浓度50%，此时提取率为12.12%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）=0.30%，与理论值接近，表明该模型得到的工艺条件准确可靠。

2.3 大果青扦叶总黄酮体外抗氧化

2.3.1 清除DPPH自由基活性

取大果青扦叶总黄酮，研究各浓度梯度总黄酮提取液和阳性对照VC对DPPH自由基的清除率，大果青扦叶总黄酮对DPPH自由基的清除率见图8。

由图8可知，在相同质量浓度范围内，大果青扦叶总黄酮及VC对DPPH自由基的清除率随着质量浓度的增大而增大，其中对DPPH自由基清除率的最大值达到50.55%。经线性拟合，大果青扦叶总黄酮对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）值为1.05 mg/mL。

2.3.2 清除ABTS+自由基活性

大果青扦叶总黄酮对ABTS+自由基的清除率见图9。

图8 大果青扦叶总黄酮对DPPH自由基清除率的影响Fig.8 Effect on DPPH free radical scavenging rates of total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

图9 大果青扦叶总黄酮对ABTS+自由基清除率的影响Fig.9 Effect on ABTS+free radical scavenging rates of total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

由图9可知，随着大果青扦叶总黄酮质量浓度由0.02 mg/mL增加到0.08 mg/mL，其对ABTS+自由基的清除率增强，总黄酮质量浓度在0.08 mg/mL，清除率达到96.06%，后续随着浓度增大清除率增加幅度变缓，表明大果青扦叶总黄酮ABTS+自由基的清除能力与浓度存在量效关系。而阳性对照VC溶液在质量浓度范围内，清除率趋近100%，说明VC对ABTS+自由基的清除效果更好。大果青扦叶总黄酮对ABTS+自由基的IC50值为0.035 mg/mL。

2.3.3 清除亚硝酸根活性

大果青扦叶总黄酮对亚硝酸盐的清除率见图10。

图10 大果青扦叶总黄酮对亚硝酸盐的清除率Fig.10 Nitrite scavenging rates of total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

由图10可知，在相同质量浓度范围内，随着VC和大果青扦叶总黄酮质量浓度的增加，对亚硝酸盐的清除率也在不断增加，在质量浓度达到3.0 mg/mL时，其清除率达到64.31%，说明大果青扦叶总黄酮的清除能力与浓度呈明显的正相关关系，其亚硝酸根的清除率与黄瑾叶总黄酮（3.0 mg/mL时清除率约69.58%）类似[27]。大果青扦叶总黄酮对亚硝酸盐的IC50值为1.98 mg/mL。

3 结论

本研究根据响应面法得到大果青扦叶总黄酮最佳超声辅助提取工艺：液料比40∶1（mL/g），超声时间63 min，超声功率 480 W，超声温度52℃，乙醇浓度50%，提取次数2次，提取量为121.18 mg/g。在体外大果青扦叶总黄酮对DPPH自由基、ABTS+自由基和亚硝酸盐表现出较好的清除效果，其总黄酮的抗氧化活性与其质量浓度呈现量效关系。本研究的结果以期为大果青扦的利用和开发提供依据。