以何首乌为核心配伍药对的指纹图谱建立及多元统计分析

张慧杰 任晓亮 孙浩 王雅琦 梁颖

摘 要 目的：建立何首烏为核心的32个配伍药对的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，并进行多元统计分析。方法：采用UPLC法，以何首乌及配伍药物的单味饮片为参照，绘制32个何首乌配伍药对的UPLC指纹图谱;采用相对保留时间及色谱峰紫外吸收光谱确定共有峰。采用SPSS 19.0软件和SIMCA 13.0软件进行无监督的主成分分析（PCA）和有监督的正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。结果：32个何首乌配伍药对的UPLC图谱有12个共有峰。无监督的PCA分析结果显示，前6个主成分的累积方差贡献率为84.633%;PCA综合评分的聚类分析结果显示，何首乌单味饮片以及何首乌与枸杞子、熟地黄、白芍、党参、墨旱莲、当归、甘草、黄芪、麦冬的配伍药对聚为一类，其余聚为一类。有监督的OPLS-DA分析结果显示，4个主成分特征值分别为2.32、2.61、1.58、0.90;在配伍过程中，何首乌与补虚类、非补虚类药物的12个共有成分含量存在差异，且与补虚药配伍后的成分含量变化具有相似性;共有峰7、4、6、3是引起差异的主要原因（变量重要性投影值均大于1）。结论：所建指纹图谱操作简便，结合多元统计分析可用于评价以何首乌为核心的32个配伍药对共有成分的含量变化。

关键词 何首乌;配伍药对;超高效液相色谱法;指纹图谱;主成分分析;正交偏最小二乘法-判别分析

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）20-2486-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.10

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of 32 compatible herb pairs with Polygonum multiflorum as the core， and to conduct multivariate statistical analysis. METHODS： UPLC method was adopted. Using P. multiflorum and single decoction pieces of compatible herb as reference， UPLC fingerprints of 32 compatible herb pairs of P. multiflorum were drawn. Common peaks were confirmed by relative retention time and UV absorption spectrum. Non-supervised PCA and supervised OPLS-DA were conducted by using SPSS 19.0 software and SIMCA 13.0 software. RESULTS： There were totally 12 common peaks in UPLC fingerprints of 32 compatible herb pairs of P. multiflorum. The results of non-supervised PCA showed that the accumulative variance contribution rate of primary 6 principal components was 84.633%. The results of cluster analysis of PCA comprehensive score showed that single decoction piece of P. multiflorum， compatible herb pairs of P. multiflorum with Lycium barbarum， Rehmannia glutinosa， Paeonia lactiflora， Codonopsis pilosula， Eclipta prostrate， Angelica sinensis， Glycyrrhiza uralensis， Astragalus membranaceus and Ophiopogon japonicus were clustered into one category; others were clustered into one category. Results of supervised OPLS-DA analysis showed that eigen values of 4 principal components were 2.32， 2.61， 1.58 and 0.90， respectively. There were differences in the contents of 12 common components in the compatibility of P. multiflorum with tonic medicine and non-tonic medicine. The changes of the content of the components after compatibility with tonic medicine were similar. Common peak 7， 4， 6， 3 were main reasons for the differences （variable importance projection value were all higher than 1）.CONCLUSIONS： Established fingerprint is simple in operation， and can be combined with multivariate statistical analysis to evaluate the content changes of common components of 32 compatible herb pairs with P. multiflorum as the core.

KEYWORDS   Polygonum multiflorum; Compatible herb pairs; UPLC; Fingerprint; PCA; OPLS-DA

中药复方是在中医理论指导下，依据“七情”及“君臣佐使”原则，由两味或两味以上的中药配伍而成[1]。复方是中药临床应用的主要形式，由于时、地、人、病、症的不同，中药组方形式多样，且配伍而成的化学成分体系十分复杂[2-3]，因此有必要对配伍机理进行深入研究。随着分析技术的不断发展，采用现代研究手段对中药配伍过程中成分及含量变化进行分析已成为配伍机理研究的重要内容之一，其中指纹图谱技术及多元统计分析方法已被广泛应用于中药多成分分析等领域中[4-5]。

何首乌又名首乌、地精，为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根[6]。該药始载于北宋《开宝本草》[7]，其炮制品为中医临床常用的滋补名药，具有补肝肾、益精血、乌髭发的功效，常与牛膝、当归、枸杞子、山楂、泽泻等中药配伍应用，治疗肝肾两虚、精血不足引起的头晕眼花、脱发白发以及高脂血症、白癜风等疾病，疗效显著[8]。然而，近年来何首乌所导致的肝毒性引起了学者的广泛关注。有研究发现，不同质量的茯苓、甘草、三七与何首乌配伍后，可显著减轻何首乌对肝窦内皮的损伤作用[9]。这提示，配伍得当可能是减轻何首乌致肝损伤的途径之一。但若配伍不当亦可导致某些不良反应的发生，如莱菔子与何首乌同用可引发头晕、神志恍惚等症状[10]。因此，配伍研究对于保障何首乌的有效性及安全性具有重要意义[8，11]。目前，少见有关首乌配伍研究的报道，且也未见有关何首乌在复方配伍过程中化学成分变化的相关研究。

药对是指经过临床应用并被证明行之有效的、具有一定理论依据的、符合一定组合法度的两味相对固定的药物配对，是中医临床遣药组方常用的配伍形式，其组成简单且兼具中药配伍的基本特征[12-13]。本课题组前期对2015年版《中国药典》（一部）中含有何首乌的61种成方制剂进行数据挖掘分析，经Apriori算法关联得到36个何首乌药对，配伍药物包括32个植物来源中药以及4个动物来源中药[14]。基于上述研究，本文拟通过建立32个何首乌配伍药对（植物来源）的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，同时采用无监督的主成分分析（PCA）、有监督的正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA），评价何首乌与32个配伍药物在共煎过程中的成分含量变化，旨在为何首乌配伍机理研究和安全用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY 型UPLC系统，包括二元溶剂管理系统、样品管理器、二极管阵列检测器（美国Waters公司）;BT125D型十万分之一天平（德国Sartorius公司）;JA31002型万分之一电子天平（上海精天电子仪器有限公司）;KDM型调温电热套（山东省鄄城永兴仪器厂）;TG16-WS型台式高速离心机（湖南省湘仪离心机仪器有限公司）;KH3200B型超声波清洗器（江苏省昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

何首乌饮片（批号：150802，四川新荷花中药饮片有限公司）、32个单味饮片均经天津市中医药研究院附属医院药学部孙浩副主任药师鉴定分别为蓼科植物何首乌P. multiflorum Thunb.的干燥块根以及相应药材的真品。单味饮片信息见表1，药对配伍信息见表2。甲醇、甲酸均为色谱纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 UPLC指纹图谱分析

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1 min，5%A;1～5 min，5%A→15%A;5～10 min，15%A→22%A;10～16 min，22%A→45%A）;流速：0.4 mL/min;柱温：45 ℃;检测波长：254 nm;进样量：5 μL。

2.1.2 样品溶液的制备 分别称取何首乌饮片、32个单味饮片及32个何首乌配伍药对样品（1 ∶ 1，m/m，下同）约10 g，加水200 mL浸泡1 h，回流提取1 h，趁热以三层纱布滤过，滤液冷却后，用水定容至200 mL，即得何首乌饮片样品、32个单味饮片样品及32个何首乌配伍药对样品溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取何首乌饮片样品4 mL，置于10 mL量瓶中，放至室温，加入50%甲醇稀释至刻度，涡旋混匀，以0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得何首乌饮片供试品溶液。同法操作制得32个单味饮片及32个何首乌配伍药对的供试品溶液。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.3”项下何首乌饮片供试品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以8号峰（响应较强且峰形好）为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对峰面积的RSD均不高于1.52%（n=6），相对保留时间的RSD均不高于1.04%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取“2.1.3”项下何首乌饮片供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对峰面积的RSD均不高于1.44%（n=6），相对保留时间的RSD均不高于1.15%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取何首乌饮片样品溶液适量，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对峰面积的RSD均不高于1.95%（n=6），相对保留时间的RSD均不高于1.79%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.7 UPLC指纹图谱的建立 取32个何首乌配伍药对样品，按“2.1.2”“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以何首乌饮片为参照，32个单味饮片为阴性对照，建立32个何首乌配伍药对的UPLC指纹图谱，采用相对保留时间及色谱峰紫外吸收光谱确定共有峰，详见图1、图2。由图1、图2可知，32个何首乌配伍药对中共有12个共有峰。

2.2 PCA

以12个共有峰峰面积为变量，采用SPSS 19.0软件进行无监督的PCA分析，结果见表3。由表3可知，前6个主成分的累积方差贡献率为84.63%，表明其可反映样品的基本信息。

2.3 OPLS-DA

“2.2”项下研究结果显示，大部分与补虚类药物配伍的何首乌药对的成分与何首乌饮片相似，提示何首乌与补虚类及非补虚类药物配伍后其成分变化可能不同。故将32个何首乌配伍药对分为补虚类与非补虚类两类，每种药对样品平行3次，采用SIMCA 13.0软件进行有监督的OPLS-DA分析。结果显示，共得到4个主成分，特征值分别为2.32、2.61、1.58、0.90，模型决定系数（R 2）为0.752、预测优度参数（Q 2）为0.712，均大于0.5，表明所建模型具有良好的识别与预测能力[16]，详见图4。由图4可知，何首乌与补虚类配伍药对分布在得分图的左侧，何首乌与非补虚类配伍药对分布在得分图的右侧。这提示，何首乌与补虚类、非补虚类药物在配伍过程中，12个共有峰对应成分的含量变化存在差异，而何首乌与补虚类药物配伍后的成分含量变化与何首乌饮片具有相似性。

进一步对样品的差异性进行整体分析，得到变量重要性投影值（VIP值，VIP值可反映模型拟合的贡献水平，该值越大表明该变量对结果拟合具有显著意义）[5]，以VIP值>1[16]为标准筛选造成差异的成分。结果显示，共得到贡献相对较大的4个变量色谱峰，VIP值由大到小依次为7、4、6、3号峰，详见图5。

3 讨论

本研究建立了以何首乌为核心配伍药对的UPLC指纹图谱。经方法学验证，所建方法的精密度、稳定性、重复性均符合中国药典要求;同时，以何首乌饮片为参照，32个配伍药对样品共有12个共有峰。由于配伍药对样品较多，需在建立色谱条件方法过程中通过不断调整梯度洗脱程序来保证32个配伍药对中何首乌的12个共有峰与其他色谱峰的有效分离。但因部分配伍药物存在与何首乌相同的化学成分或者结构类型相似的化学成分，而难以通过调整梯度洗脱程序将色谱峰完全分离，若采用指纹图谱相似度评价软件进行相似度分析，就会使得有些成分的峰面积存在较大误差，故本研究未进行相似度分析。此外，对上述未达到基线分离色谱峰的峰面积进行预处理：当何首乌及单味饮片在同一保留时间处均有色谱峰时，以何首乌饮片溶液中该色谱峰峰面积为a，单味饮片溶液中该色谱峰峰面积为b，何首乌与单味饮片配伍药对溶液中该色谱峰峰面积为c，由于本研究的共有峰均来源于何首乌，假设药对配伍溶液中该色谱峰峰面积的变化为何首烏中该成分的变化，故该色谱峰的峰面积为c-b，如果该值为负数，则以0表示。

PCA可对原始数据所包含的多个变量（即多指标）进行拟合，以新的低维度变量（即主成分）代替原始高维度变量，进而实现样本多指标数据的降维，体现不同中药样品聚类的相似性、中药样品与指标间的关联信息等[4，17]。PCA结果显示，何首乌单味饮片以及何首乌与枸杞子、熟地黄、白芍、党参、墨旱莲、当归、甘草、黄芪、麦冬的配伍药对聚为一类，配伍药物均为补虚类药物，提示何首乌与补虚类药物配伍后的成分含量变化具有相似性。

OPLS-DA可在有监督的情况下提取利于样品分类的变量信息，能较大程度地降低系统噪声的干扰，提高分类效能，具有较好的样本分组能力[18]。OPLS-DA结果显示，何首乌与补虚类、非补虚类药物在配伍过程中，其成分分散在两个不同区域，具有明显的差异。笔者曾尝试采用液质联用技术对VIP值>1的成分（7、4、6、3号峰）进行鉴定，但4、6号峰对应的成分在正负离子下均无响应，7、3号峰的分子质量分别为406、246，由于试验条件有限未能获得二级质谱图，故暂无法根据一级质谱推断其成分结构。虽然8号峰的质谱信息显示其结构为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，但该成分的VIP值小于0.5，提示该成分不是引起何首乌与补虚类、非补虚类药物配伍后含量差异的主要原因。

《神农本草经》中将药物的配伍关系归纳为“七情”，其中“相须”是指两种功效类似的药物配合应用，以增强原有药物的功效[19]。本研究前期试验发现，何首乌多与补虚类药物“相须”配伍入药[14]。何首乌与补虚类药物在“相须”配伍过程中其成分含量变化具有相似性，这为何首乌“相须”配伍机理研究提供了新的思路。此外，本研究中，何首乌与配伍药材均以质量比1 ∶ 1进行配伍共煎，而临床实际应用中药配伍的比例较为多样。有研究认为，不同比例的何首乌-牛膝配伍对何首乌所含成分的影响有所差异[20]。因此，不同配伍比例下的含量变化规律还有待后续研究进一步探讨。

综上所述，所建指纹图谱操作简便，结合多元统计分析可用于评价以何首乌为核心的32个配伍药对共有成分的含量变化。

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（收稿日期：2020-05-15 修回日期：2020-09-01）

（编辑：陈 宏）