一种枯草芽孢杆菌的计数方法

2020-11-30王梅卢宗梅陈影周勇邴狄祥刘利利郭世堂徐晓然

当代化工 2020年9期

王梅卢宗梅陈影周勇邴狄祥刘利利郭世堂徐晓然

摘要：为了对一株高度黏连的产多种酶的枯草芽孢杆菌进行有效的活菌计数，试验采用普通培养基，蛋白胨添加质量分数1%、0.5%，牛肉粉和牛肉膏添加质量分数0.3%，氯化钠添加质量分数1%、0.5%，琼脂粉添加量1.5%、3.0%，在不同添加量下进行活菌计数及芽孢计数研究分析。试验结果表明：普通培养基平板蛋白胨、牛肉粉和牛肉膏、氯化钠不同添加量条件下，该菌株枯草芽孢杆菌在平板显示菌落个数仍然比较大，菌落黏连在一起，造成计数偏低，难以形成有效的活菌计数，对产品质量无法准确判断。针对这种情况，最终优化出一种合适平板培养基，蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂粉3.0%（均为质量分数），使本菌能够生长并菌落独立，计数结果准确，重复性好。说明在活菌計数和芽孢计数中，优化培养基是某些特殊菌株（菌落黏连）的理想计数方法。

关键词：枯草芽孢杆菌;培养基;计数

中图分类号： TQ016.1 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2020）09-1930-04

Abstract： In order to count a highly adherent bacillus subtilis which can produce multiple enzymes， in the experiment， the viable bacteria count and spore count were studied by adding 1%，0.5% peptone， 0.3% beef powder and beef extract， 1% or 0.5% sodium chloride， 1.5% or 3.0% agar powder. The results showed that the number of colonies of Bacillus subtilis was still relatively large on the plate with the common medium containing peptone， beef powder， beef extract and sodium chloride， and the colonies adhered together， resulting in a low count， it was difficult to form an effective count of viable bacteria， and the quality of products could not be accurately judged. In view of this situation， a suitable plate culture medium was finally optimized， containing peptone 1% ， beef extract 0.3% ， sodium chloride 0.5% and agar powder 3.0% . It was shown that the optimum medium was an ideal method for counting some special strains （colony adhesion） in the enumeration of living bacteria and spores.

Key words： Bacillus subtilis; Medium; Counting

枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在。微生物饲料添加剂年产量已经超过二十几万吨，目前我国从事生物饲料行业的企业数量已经超过一千多家，发酵饲料年产品产量一百多万吨[1-2]。枯草芽孢杆菌已经作为微生物菌剂对外销售，国家对于微生物菌剂以及发酵饲料方面质量标准及控制，将不断的规范化。

枯草芽孢杆菌是一类好氧细菌，芽孢杆菌能产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，还可以抑制动物肠道中有害菌的生长，维持动物肠道的生态平衡 [3]。

微生态制剂及培养细菌的计数，一般经常使用的方法有平板稀释法、吸光值法、显微镜检测法等[4-5]，在活菌计数和芽孢计数中，目前最稳定且可靠是平板稀释计数法。

在现阶段的工业化生产中，本菌株枯草芽孢杆菌生长繁殖迅速，普通培养基平板计数，菌落黏连在一起，单独菌落个数比较大，活菌数和芽孢数计数偏低，对产品质量无法准确判断，针对这种情况，进行培养基优化，调整氮源、碳源、有机盐、琼脂粉添加量，最终优化培养基使本菌能够生长并且菌落独立、准确计数。

1 实验部分

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus sublilis）由中粮生物科技股份有限公司研发基地分离、鉴定并保存菌种，菌种编号ZLK1。

1.2 培养基

普通培养基：蛋白胨10 g，牛肉粉3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL， pH 7.0+0.2，121 ℃灭菌20 min。

优化培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂粉30 g，蒸馏水1 000 mL， pH 7.0+0.2，121 ℃灭菌20 min。

1.3 试验方法[6]

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。

首先将培养皿装进不锈钢桶里，然后放入烘箱180 ℃干热灭菌2～3 h，放无菌室净化台冷却待用。

分别将配好的普通培养基和优化培养基121 ℃灭菌20 min，冷却至50～40 ℃左右，在无菌室净化台上，将其倒入已干热灭菌的培养皿中，约 20 mL/90 mm培养皿，等冷却凝固后，把倒置培养皿放入35 ℃培养箱中空培养24～48 h，最后把培养皿装进不锈钢桶里，放置4 ℃冰箱保存备用。

准确的称取样品5.00 g（或5.00 mL），置入 45 mL无菌水的带挡板的三角瓶中，震荡器震动 30 min，即为1∶10的稀釋液。

从1∶10的稀释液中吸取0.1 mL置入0.9 mL无菌水的玻璃试管中，用振荡器混匀。

依次按照10倍的稀释液稀释，每次稀释前，一定要换无菌的吸头，选择合适的稀释梯度，吸取 0.1 mL稀释液放入空培养的平板中，用涂布棒将稀释好的菌液涂布均匀，每个稀释梯度涂几块平行平板，倒置于30 ℃恒温培养箱中，培养24 h后取出计数。

选取菌落数在30～300个之间的平皿计数，不黏连、单独菌落生长的平皿计算菌落总数。大于300个菌落的平皿记录为不可计。低于30个菌落的平皿记录具体菌落数，每个稀释梯度的菌落数取3块平皿的平均数，若只有一个稀释梯度平皿上的菌落数在适宜计数范围内，计算2块平皿菌落数的平均值，取平均值乘以相应稀释倍数，即得每克或每毫升样品所含枯草芽孢杆菌发酵液活菌的总数。

1.4 主要设备

培养箱，MIR-162三洋恒温培养箱，旋涡震荡器，分析天平，YXQ高压灭菌锅，水浴锅，90 mm培养皿，蜀牛牌三角烧瓶（规格1 000 mL和250 mL），移液器，移液枪头，1 mL和5 mL吸管，离心管，18×180试管，涂布棒，不锈钢培养皿桶，电磁炉，不锈钢锅。

2 结果与讨论

2.1 蛋白胨

蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂，蛋白胨当中不仅含有丰富的氨基酸、细菌需要生长的维生素和其他生长因子，还含有许多硫氨基酸等。蛋白胨在培养基当中起的主要作用是提供氮源。

有机氮源不但含有某些生长因子以及少量脂肪、糖类、维生素，而且含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸等。因此在含有有机氮源的培养基中微生物不但生长特别旺盛，而且菌体数量增长快速，代谢产物积累丰富 [7-8]。

由表1可知优化后培养基调整氮源从1.0%降到0.5%，用枯草芽孢杆菌发酵终点种子液稀释涂布，结合图1分析可知，调整氮源添加量对菌落生长、蔓延没有影响，菌落个数依然比较大，菌落易黏连在一起。

2.2 牛肉粉和牛肉膏

牛肉粉则以牛肉为原料，经热处理，过滤，浓缩，干燥制成牛肉原粉，再将牛肉原粉经过水解，固液分离，冷藏，过滤，浓缩及干燥等工序即可获得牛肉粉，其能为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素。牛肉粉和牛肉膏的作用同为微生物提供碳源、磷酸盐、维生素。牛肉粉添加量0.3%，牛肉膏添加量0.5%、0.3%。结果如图2所示。

普通培养基牛肉粉添加量0.3%牛肉粉和优化培养基牛肉膏添加量分别为0.3%、0.5%。同样用枯草芽孢杆菌发酵终点种子液稀释涂布，由平板结果显示，牛肉膏添加0.3%和0.5%在平板培养基中无明显区别。用牛肉粉替代牛肉膏是可行的。由图2菌株形态可知，菌落个数依然大，菌落易蔓延，无法准确计数。牛肉粉和牛肉膏添加培养基中对菌落生长影响不明显。

2.3 氯化钠

氯化钠是微生物发酵培养基的必要成分，钠离子能够维持细胞渗透压，因此需要在培养基中加入少量的钠盐，但添加量不能过高，否则影响微生物的生长[8-9]。枯草芽孢杆菌在5%的NaCl溶液中能正常生长，而在10%的NaCl溶液中生长受到抑制。

优化普通培养基中的氯化钠添加量，由0.5%调整到1%，同样用枯草芽孢杆菌发酵终点种子液稀释涂布，结果如图3所示，菌落个数依然大，菌落生长易蔓延、易黏连一起，无法准确计数。1%氯化钠添加量未影响枯草芽孢杆菌生长。说明氯化钠添加量0.5%和1%对枯草芽孢杆菌生长及菌落变化没有显著影响，只有在10%的NaCl溶液中枯草芽孢杆菌生长受到抑制。

2.4 琼脂粉

琼脂粉不溶于冷水，缓溶于热水中，更容易在沸水中溶解 [10]。琼脂起凝固剂作用，在普通培养基的基础上优化培养基中的琼脂粉由1.5%调整到3.0%，配制成平板培养基，同样用枯草芽孢杆菌发酵终点种子液稀释涂布，结果如图5所示，菌落呈圆形，边缘整齐，不蔓延，菌落独立生长，比普通培养基中琼脂粉多加一倍。

2.5 普通培养基和优化培养基配方对比

由表2可知，普通培养基里用的是牛肉粉，而优化培养基用的是牛肉膏，普通培养基的琼脂粉添加量是1.5%，而优化培养基的琼脂粉添加量是3.0%，琼脂粉多加一倍的量。

2.6 两种平板多次计数对比结果

研究对枯草芽孢杆菌进行普通培养基平板和优化培养基平板多次计数，表3是取3次枯草芽孢杆菌发酵液活菌计数的结果。由表3可知，普通培养基平板计数的结果比较低，而从优化培养基平板计数的结果来看，梯度性、平行性非常好，菌落易计数。另外，从涂平板后菌落的独立生长易计数。说明琼脂粉添加量由1.5%调整到3.0%，根据平板结果可知，优化培养基平板菌落分布均匀、独立，该方法也非常稳定、可靠。

2.7 枯草芽孢杆菌芽孢菌落计数[6]

首先以无菌操作称取枯草芽孢杆菌发酵液5 mL，加入45 mL 0.85%灭菌生理盐水中，用振荡器混匀1～2 min，制成1∶10的初始悬浮液。吸取1∶10的初始悬浮液1 mL，加入9 mL 0.85%灭菌生理盐水中，经振荡器混匀后制成1∶100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。

选择2～3个适宜的稀释度，水浴（80±1） ℃维持10 min，用无菌移液枪头吸取0.1 mL，接种到培养皿中，使用涂布棒均匀分布于平皿中的培养基内，涂布好的平皿盖好，置室温放置15 min使接种物完全被琼脂吸收。放置30 ℃恒温培养箱培养24 h后，如图4所示，在普通培养基平板上有10-6 53个菌落，菌落呈水滴状，好多菌落黏连在一起，菌落比较大，易覆盖其他菌落，无法准确计数。

优化培养基如图5所示，菌落呈圆形，边缘整齐，在同一个梯度上，10-6 152个菌落，优化培养基的菌落比普通培养基培养菌落生长的个数多，易准确计数。

结果表明，该菌株在普通培养基平板上生长，菌落呈水滴状且具有较高黏连性，不适合在普通培养基培养计数。而在优化培养基中琼脂粉添加质量分数由1.5%提高3.0%，使培养基硬度适宜，不影响本菌株生长，菌落边缘不蔓延，不黏连在一起，菌落边缘整齐，菌落分布均匀，能够准确计数。

通过对培养枯草芽孢杆菌平板培养基各项指标分析及对比验证，该菌株枯草芽孢杆菌适宜在优化培养基中培养，不会抑制菌落生长，菌落边缘整齐，不蔓延，不黏连在一起，易准确菌落计数。因此，在活菌计数和芽孢计数中，优化培养基是适合本菌株枯草芽孢杆菌的最佳计数方法。

参考文献：

[1]陈影，卢宗梅，张琳，等. 发酵饲料分析检测技术[J].当代化工， 2019，48（9）：2060-2063.

[2]宁明刚，赵运，赵明礼，胡旭.一例猪丹毒的诊断与防控[J].北方牧业，2018（32）：26.

[3]邓露芳，王加启，朴登攀，等.纳豆芽孢杆菌作为益生菌饲用的研究现状[J].中国畜牧兽医，2007，34（10）：5-8.

[4]魏鸿刚，李元广，刘健，等.一种快速的活菌计数新方法研究[J].微生物学通报，2002，29（2）：89-93.

[5]刘宝生，余占桥.一株高度黏连的枯草芽孢杆菌的活菌计数[J].黑龙江畜牧兽医，2011（9）：19-21.

[6]GB/T 26428-2010，饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测企业标准[S].

[7]廖春丽，王福梅，王莲哲，等.蛹虫草产胞外多糖发酵培养研究[J].安徽农业科学，2009，37（9）：3937-3938.

[8]胡海荚.培养基的组成[J].江西化工，2004（4）：62-63.