基于低场核磁共振技术分析离子液体对水稻萌发及幼苗生长的影响

徐 静，宋 平，苗 腾，金 莉，罗海艳

（沈阳农业大学 信息与电气工程学院，沈阳 110161）

水稻是一种重要的粮食作物，中国是世界最大的稻谷消费国，水稻的总产量居世界之首。 离子液体（ionic liquids， ILs）是在室温或室温邻近温度下由离子构成的呈液体的有机物质，因其高热稳定性和非易燃性，在分离工程、有机合成、电化学及材料加工等领域具有广泛的应用前景[1-2]，被称为替代传统挥发性有机溶剂的“绿色溶液”。但是，离子液体在水中的溶解度较高，不易降解[3]，因此在环境降解、残留等方面具有潜在的环境风险。随着离子液体研究的不断深入，以及应用领域的不断扩展，其残留物不可避免的要流失到自然环境中，其生态毒性已引起研究者的关注。有关研究表明，离子液体对藻类[4]、微生物[5-6]、动物[7]会产生不同程度的毒性，对农作物的生长发育产生抑制影响[8-10]。 低场核磁共振（low field nuclear magnetic resonance， LF-NMR）是一种非损伤、非侵入式的分析检测技术，通过质子核共振谱弛豫时间，进行核磁共振波谱分析（magnetic resonance spectroscopy， MRS）获取样本内部水分含量和分布的信息，实现对样本无损、快速检测，被广泛应用于农业食品、石油化工、材料科学等领域[11-16]。宋平等[17]应用低场核磁共振技术，开展水稻种子侵种过程内部水分流动的研究。渠琛玲等[18]利用低场核磁共振技术研究干燥过程中花生仁内部含水率的变化，建立干燥过程花生仁含水率预测模型。 程天赋等[19]基于低场核磁共振横向弛豫时间分析解冻过程中肌原纤维水的分布及流动性与鸡肉食用品质间的联系。 但利用低场核磁共振技术检测离子液体胁迫下萌发期种子内部水分变化的研究鲜有报道。 本研究以水稻种子为研究对象，以低场核磁共振波谱分析为手段，分析在不同质量浓度的离子液体溴化盐（[HMIM]Br）胁迫处理下，萌发期水稻种子的吸水率及吸水情况的变化规律，明确离子液体对种子吸水量和水稻幼苗生长的影响，以期为离子液体的安全使用及有关生态风险评估提供一定的参考依据，并提供一种快速无损的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以水稻种子为试验对象，供试水稻种子品种为美锋669，来自辽宁东亚种业有限公司。 离子液体为溴化盐（[HMIM]Br），由沈阳农业大学理学院无机化学实验室提供。 试验于2019 年4～6 月在沈阳农业大学信息与电气工程学院核磁共振检测实验室进行，试验选择饱满、外形均匀的水稻种子1600 粒，每40 粒为1 组，共40 组， 称重后用蒸馏水洗净在恒温下泡发24h， 然后将每组40 粒种子分别均匀摆放在装有质量浓度为4，6，8，10，12，14，16mg·L-1的溴化盐的培养皿中，每个浓度重复 5 次，以蒸馏水培养作为对照，在 28℃恒温箱中进行催芽。 催芽48h 后，将不同浓度处理及对照组水稻种子从培养皿中取出，利用低场核磁共振仪获取样本的横向弛豫时间的反演谱，分析样本中水分子的流动特性。测完数据后的样本，继续放回对应培养皿中，在培养箱中进行育苗。培养箱光照由弱到强共有4 种选择（0～3），模拟种子发育的自然条件，将培养箱设置为2h 25℃2 光照，8h 28℃ 3 光照，2h 26℃ 1 光照，12h 26℃ 0 光照，相对湿度90%，每天定时更换培养皿中各浓度的离子液体。在120h，检测水稻种子的发芽势。在336h，检测水稻种子的发芽率。在144，192，216，240，264h 用直尺测量每个培养皿中随机选取的10 株幼苗的苗长。

1.2 试验设备

本研究利用低场核磁共振分析仪 NNMI20-015V-I（上海纽迈电子科技有限公司），磁场强度（0．5±0．08）T，射频脉冲频率18MHz；磁体温度32℃；探头线圈直径5mm。 智能人工气候培养箱RTOP-268D（浙江托普仪器有限公司），控温范围 0～50℃，温度波动度±0．5℃，温度均匀度±1℃，控湿范围 50%～95%RH，温度波动±5%RH，可设定 1～30 个温度、时间、光照段。

1.3 方法

1.3.1 核磁共振技术 核磁共振技术主要包括核磁共振波谱分析和核磁共振成像。 其中核磁共振波谱分析是利用核磁共振信号经傅立叶转换得到波谱信号，利用波谱信号进行定量分析检测，主要通过横向弛豫时间T2反演波谱反映样本内部水分子分布情况。核磁共振成像是利用核磁共振基本原理，依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，得到构成物体原子核的位置和种类，经电子计算机绘制出物体内部的结构图像。 本研究主要采用核磁共振波谱分析技术。

1.3.2 核磁共振波谱试验 水稻种子在恒温箱中催芽48h 后， 利用低场核磁共振仪获取样本的横向弛豫时间的反演谱。核磁共振波谱分析系统中，硬脉冲回波（carr-purcell-meiboom-gill sequence， CPMG）序列参数是根据硬脉冲自由感应衰减（free induction decay， FID）序列寻找的中心频率及硬脉冲脉宽设置的。 试验前，首先将标准油样试管放置于低场核磁共振分析仪磁体箱的中心位置，通过FID 序列标定中心频率及90°，180°脉冲脉宽。本试验设置的参数值为：主频 SF=21MHZ，90°脉冲脉宽 P1=17．52 μs，180°脉冲脉宽 P2=35．52 μs。 然后将不同浓度处理及对照组水稻种子从培养皿中取出，用吸水纸吸干样品表面水分，将其装入试管中放入磁体箱的中心位置，利用CPMG 脉冲序列进行检测，获取不同质量浓度离子液体处理下的水稻种子的T2反演波谱。CPMG 脉冲序列参数值为：回波个数NHCH=6000，重复次数NS=16，每个样本重复采样4 次获得样本的T2弛豫时间，并通过反演运算得到样本的T2反演波谱。

1.3.3 指标测试 样本种子指标的测定按种子质量国家标准进行。 水稻种子发芽试验的初次计数时间为5d，末次计数时间为14d。 分别在120h 和336h 测定不同质量浓度离子液体处理的样本发芽势和发芽率， 并在144，192，216，240，264h 用直尺测量每个培养皿中随机选取的10 株幼苗的苗长。

1.3.4 数据处理 本研究核磁共振采集分析软件为上海纽迈电子科技有限公司的纽迈核磁共振分析应用软件，采集CPMG 脉冲序列核磁信号，每组样本重复4 次，将平均值进行核磁共振反演得到样本的T2反演波谱。将样本的 T2反演波谱数据应用 SPSS 21．0（IBM，Chicago，USA）和 Hxcel 2013（Microsoft，USA）进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度离子液处理的水稻种子萌发期水分分布

根据低场核磁共振原理可知，横向弛豫时间T2与氢质子的种类及所处状态存在密切关系，横向弛豫时间的长短反映样本内部水分自由度的大小，通常横向弛豫时间分成短横向弛豫时间和长横向弛豫时间，其中横向弛豫时间在0．1～10ms，看作短弛豫时间，代表样本内部结合水分布情况，在10～100ms，看作长弛豫时间，代表样本内部自由水分布情况。 对于不同质量浓度离子液处理下的水稻种子，在处理的第48h 获取每组种子样本的核磁共振 T2反演波谱数据，在反演频率为 10000 时，对照组和质量浓度为 4，6，8，10，12，14，16mg·L-1的 T2反演波谱（图1）。 T2反演波谱数据横坐标为横向弛豫时间，纵坐标为单位质量浓度样品核磁共振信号幅值，横向弛豫时间越大，代表水分子的结合性越稀疏，核磁共振信号幅值越强，样本内部含水率越大。 由图1 可知，对照组和不同质量浓度离子液处理下的水稻种子样本T2反演波谱均有2 个波峰， 横向弛豫时间0．1～10ms 和10～100ms，随着离子液质量浓度的增大，种子样本内部结合水和自由水的峰面积均表现为逐渐减小，可以看出在离子液的处理下，水稻种子样本的含水率在不断减小，表明由于离子液的处理限制了水稻种子的吸水能力，离子液质量浓度越大，限制作用越大。

图1 不同质量浓度处理下水稻种子的T2 反演波谱Figure 1 T2 inversion spectrum of rice seeds under different solutions

2.2 不同质量浓度离子液处理的水稻种子各相态水分含量

种子水分是种子维持其正常活力的必需物质，种子水分的含量通常是测定种子内部结合水和自由水的含量。 有关研究显示，核磁共振横向弛豫谱信号幅值与种子内部含水率具有显著的线性关系[20-22]，可以利用核磁共振信号幅值估测种子内部含水率情况。 本研究利用核磁共振T2反演波谱，获取不同质量浓度离子液处理的水稻种子样本核磁共振信号幅值（图2）。 由图2 可知，在离子液的处理下，水稻种子样本中结合水和自由水的含量有着明显的差异，随着离子液质量浓度的增大，水稻种子样本内部的结合水和自由水的含量减小，吸水能力下降，并在质量浓度大于等于8mg·L-1变化显著。

图2 不同质量浓度处理下水稻种子各相态水分Figure 2 Phase state water of rice seeds under different solutions

2.3 不同质量浓度离子液处理对水稻种子发芽的影响

对不同质量浓度离子液处理的水稻种子样本核磁共振横向弛豫时间信号数据的分析，可以看出离子液对水稻种子的吸水能力具有一定的抑制作用，并随着浓度的增大抑制作用越明显。 为了进一步确定这种影响，在培养箱中进行育苗，并分别在120h 和336h 对水稻种子样本统计发芽力（表 1）。 在 144，192，216，240，264h 用直尺测量每个培养皿中随机选取的10 株幼苗的苗长（表2）。 由表1 和表2 可知，随着离子液质量浓度增大，水稻种子的发芽能力呈下降趋势， 幼苗的生长受到抑制。 这与核磁共振的检测结果一致。

表2 不同质量浓度处理下水稻幼苗苗长Table 2 Seedling length under different solutions

表1 不同质量浓度处理下水稻种子发芽力Table 1 Germinative ability of rice seeds under different solutions

3 讨论与结论

近年来，低场核磁共振技术作为一种新兴的无损检测方法，广泛应用于农业食品、生命科学、石油化工等领域。国内一些学者，利用核磁共振弛豫时间T2反演波谱，开展食品含水、含油率，果蔬中水分的分布及水分的流动性，食品的保鲜和贮藏，速冻食品的品质，农作物种子浸种过程水分传递等方面的研究。周然等[23]为研究可食性涂膜对冷藏黄花梨的保鲜效果，利用核磁共振成像检测不同保鲜膜浸涂的黄花梨储藏后内部品质，结果确定通过涂膜可达到贮藏保鲜的目的，同时虫胶涂膜能更有效地保持黄花梨的品质。宋平等[24]基于核磁共振技术研究不同水稻浸种方法对水稻种子吸水量的影响，通过硬脉冲回波序列测定水稻种子横向弛豫时间，分析水稻种子内部水分相态及其变化规律，揭示水稻种子含水量的影响因素，为水稻浸种过程中吸水量的测定提供一种有效的方法。 但目前，基于核磁共振技术研究离子液对农作物种子吸水性影响未见相关报道。

本研究结果表明，根据横向弛豫时间的不同，将水稻种子样本内部的水分划分成结合水和自由水2 种水分相态。 横向弛豫时间在0．1～10ms 的结合水和横向弛豫时间在10～100ms 的自由水，随着离子液体浓度的增大，反射峰面积逐渐减小，结合水和自由水的含量减小，并在质量浓度大于等于8mg·L-1变化显著。 对水稻种子样本的发芽能力和水稻幼苗苗长的检测，也表明离子液体降低了水稻种子的发芽率，对水稻幼苗的生长起到抑制作用，这与核磁共振检测结果一致，证明核磁共振检测结果的可靠性。