非小细胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9的表达及意义

郭涛弦 范红松 罗勤

四川省眉山市人民医院检验科620010

肺癌大多起源于支气管黏膜上皮,随着病情不断进展,肿瘤可向支气管腔内和/或邻近的肺组织生长,且可经支气管、血行、淋巴转移扩散。在所有肺癌病例中,非小细胞肺癌 (non-s mall-cell l ung cancer,NSCLC)约占85%,相比小细胞肺癌而言,其扩散转移相对较晚、癌细胞生长分裂较慢,但多数患者因无典型的早期症状,故诊断时常处于中晚期,早期确诊率较低,5 年生存率较低[1]。分子生物学研究发现,在肿瘤的发展、侵袭、转移等一系列病理过程中,肿瘤细胞的某些基因活性表达发挥着重要作用[2-3]。因此,需积极寻找一种新的非侵入性血清生物标志物,以促进NSCLC的早期诊断、早治疗,改善患者预后。基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)属于一组钙和锌依赖性酶,可降解细胞外基质中诸多成分,与肿瘤等多种疾病发生、进展息息相关[4]。S100蛋白家族包括25 个钙结合蛋白,在上皮-间质转化、细胞侵袭及分化过程中均发挥重要作用,且其多个成员与细胞周期进程及炎症反应有关[5]。鉴于此,本研究就非小细胞肺癌患者血清S100钙结合蛋白A8/钙粒蛋白A (ser u m S100 cal bindin A8,S100 A8)、S100 A9、MMP-9 的 表达及意义进行如下分析,旨在指导临床合理诊治。具体信息如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 将2017年1月至2020年1月于四川省眉山市人民医院就诊的16例NSCLC 患者纳入NSCLC组进行回顾性研究。纳入标准：符合《肺癌筛查与管理中国专家共识》[6]中相关诊断标准并经病理学(手术后病理标本或细针穿刺标本)确诊为原发性NSCLC 患者;国际抗癌联盟TNM 分期为Ⅰ～Ⅲ期;未接受过任何放化疗、免疫治疗等;凝血功能正常。排除标准：伴有其他恶性肿瘤;肝肾功能不全。其中男10例,女6例;年龄(61.23±4.98)岁,年龄范围为42～82岁;组织学类型：腺癌9例,鳞癌7例;TNM 分期：Ⅰ期5例,Ⅱ期7例,Ⅲ期4例;组织分化：低分化6例,中高分化10例;淋巴结转移7例,淋巴结未转移9例;肿瘤大小直径：≥3 c m 6例,<3 c m 10例。将同期20 例肺部良性疾病患者作为良性组,其中男13 例,女7例;年龄 (60.76±4.47)岁,年龄范围为40～83岁。另选同期20名健康受试者作为对照组,其中男14 名,女6 名;年龄(61.15±4.82)岁,年龄范围为39～81岁。3 组受试者年龄、性别分布均衡性良好 (P值均>0.05),可对比。本研究通过四川省眉山市人民医院医学伦理委员会批准(HC20160097),且所有受试者均于知情书上签字。

1.2 方法 于所有受试者入院当天取其清晨空腹外周血5 ml,室温下,以转速为3 000 r/min、半径为6 c m 进行10 min的离心,离心机为北京白洋医疗器材有限公司生产的BY-600C 型医用离心机。取上清液,置于-80 ℃冰箱中 [型号SANYO MDF-382E (N)冰箱,日本三洋公司]待测。通过酶联免疫吸附法测定3 组血清S100 A8、S100 A9、MMP-9水平,其中S100 A8、S100 A9试剂盒购自上海将来实业股份有限公司,MMP-9试剂盒购自广州市安杰生物技术有限公司。所有操作均严格按照说明书执行,且遵循无菌操作。

1.3 观察指标 对比健康组、良性组、NSCLC组的血清S100A8、S100 A9、MMP-9 表达差异,经受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic cur ve,ROC)分析血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达预测NSCLC 的诊断价值;对比NSCLC 不同病理特征患者的血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达差异,并进一步分析各指标与不同病理特征的相关性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行数据处理,计量资料以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,采用SNK-q行组间两两检验。绘制ROC 得到曲线下面积 (area under the curve,AUC),检验血清S100 A8、S100 A9、MMP-9 表达预测NSCLC的诊断价值：AUC<0.5无价值,≥0.5且<0.7诊断价值较低,≥0.7且≤0.9诊断价值中等,>0.9诊断价值高。相关性采用Spear man等级相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达 NSCLC组血清S100A8、S100 A9 及MMP-9 水平均>良性组>健康组,差异均有统计学意义 (P值均<0.05),见表1。

2.2 血 清S100 A8、S100A9、MMP-9 表 达 预 测NSCLC的诊断价值 绘制ROC 结果显示,血清S100A8、S100 A9预测NSCLC的AUC分别为0.953、0.977,诊断价值高;血清MMP-9预测NSCLC的AUC为0.846,诊断价值中等。见表2、图1。

表2 血清S100 A8、S100 A9、MMP-9的受试者工作特征曲线结果

图1 血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达预测非小细胞肺癌的受试者工作特征曲线图

2.3 不同特征非小细胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达 不同组织分化、TNM 分期的S100 A8、S100A9、MMP-9 表达相比,差异均有统计学意义(P值均<0.05);淋巴结是否转移的MMP-9 相比,差异有统计学意义 (t=2.321,P<0.05),见表3。经Spear man 等级相关分析法发现,S100 A8、S100 A9、MMP-9 表达与组织分化程度均呈负相关 (r= -0.585、-0.421、-0.684,P值均<0.001),与各TNM分期均呈正相关 (r=0.532、0.712、0.683,P值均<0.001);且MMP-9表达与有无淋巴转移相关(r=0.811,P<0.001)。

3 讨论

肺癌是临床上常见的肺部恶性肿瘤。近年来我国NSCLC发病率呈总体上升趋势,而浸润、转移是造成NSCLC患者死亡的主要原因之一。肿瘤的浸润、转移属于一个多步骤、多因素的连续化复杂过程,诸多基因参与其中,且与基因的调控、表达息息相关[7]。故积极探讨一种敏感度高、非侵入性的肿瘤标志物在临床诊治恶性肿瘤中意义重大。

细胞基质及细胞基膜是肿瘤转移过程中的天然屏障,此过程会激发机体释放蛋白酶类,以促进细胞基质降解。而MMPs在肿瘤转移期间发挥重要作用,其是降解细胞外基因不可或缺的酶,且表达水平可作为判断NSCLC 患者不良预后的指标[8-9]。MMP-9参与肿瘤血管网络构建及延伸过程中,作为MMPs家族中分子量最大的酶,其主要功能在于降解及破坏Ⅳ、Ⅴ型胶原及明胶等细胞外基因中最主要的组分,且可降解基底膜,降低肿瘤细胞穿透基底膜浸润结缔组织基质的难度,进而对肿瘤转移、浸润等过程产生一定的影响[10-11]。本研究中,NSCLC组血清MMP-9水平最高,其次为良性组,最低为健康组,预测NSCLC 的AUC>0.8,诊断价值中等,且不同组织分化、TNM 分期及淋巴转移是否转移患者的MMP-9 水平差异有统计学意义,从而可推断MMP-9与NSCLC的发生、淋巴结转移、高低分化等密切相关,可作为病情恶化的潜在标志。

表1 3组血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达对比 (±s)

表1 3组血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达对比 (±s)

注：S100 A8为S100钙结合蛋白A8;S100 A9为S100钙结合蛋白A9;MMP-9为基质金属蛋白酶9

组别 例数 S100 A8 (μg/L) S100 A9 (ng/L) MMP-9 (μg/L)健康组 20 2.09±0.26 171.08±17.03 131.70±16.68良性组 20 4.02±0.48 203.87±23.06 160.28±17.62 NSCLC组 16 6.13±0.75 261.97±28.85 180.62±20.12 F 值 273.116 69.954 33.589 P 值 <0.001 <0.001 <0.001

表3 不同特征非小细胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达 (±s)

表3 不同特征非小细胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表达 (±s)

注：S100A8为S100钙结合蛋白A8;S100 A9为S100钙结合蛋白A9;MMP-9为基质金属蛋白酶9

项目 例数 S100A8 (μg/L)S100 A9 (ng/L)MMP-9 (μg/L)水平 统计值 P 值水平 统计值 P 值水平 统计值 P 值性别 t=0.397 0.697 t=0.267 0.793 t=0.173 0.865男10 6.24±0.76 264.16±29.13 179.34±19.65 女 6 6.09±0.68 260.09±30.24 181.16±21.57年龄 t=0.379 0.710 t=0.060 0.953 t=0.288 0.777 ≥60岁 12 6.19±0.81 262.24±30.46 183.45±20.07 <60岁 4 6.02±0.64 261.18±31.47 180.07±21.17组织学类型 t=0.833 0.418 t=0.132 0.897 t=0.212 0.835 腺癌 9 6.31±0.74 260.46±29.86 182.24±20.07 鳞癌 7 5.99±0.79 262.47±30.75 180.04±21.27 TNM 分期 F =8.947 0.004 F =8.269 0.005 F =4.683 0.029 Ⅰ期 5 5.01±0.61 211.21±26.67 158.86±18.84 Ⅱ期 7 5.97±0.76 259.75±30.04 181.16±20.75 Ⅲ期 4 7.11±0.85 289.97±32.37 201.04±22.76组织分化 t=2.949 0.010 t=3.680 0.002 t=3.682 0.002 低分化 6 6.89±0.78 291.46±33.12 207.16±21.49 中高分化 10 5.76±0.72 231.87±30.34 169.46±18.84淋巴结是否转移 t=0.687 0.505 t=0.244 0.811 t=2.321 0.039 是 7 6.31±0.79 263.34±30.21 191.61±21.17 否 9 6.02±0.72 259.27±29.75 164.52±20.75肿瘤直径 t=0.238 0.815 t=0.441 0.666 t=1.193 0.251 ≥3 c m 6 6.19±0.72 264.24±29.94 186.64±20.45 <3 c m 10 6.10±0.74 257.34±30.49 174.32±19.74

S100家族属于钙离子结合蛋白,共包含23个成员,且含有可与钙离子高亲和性、高选择性结合的14个氨基酸序列,与钙离子结合后可参与细胞分化、增殖、凋亡及基因表达、分泌、肌肉收缩等过程[12]。其中S100A8 定位于人染色体1q21,该区具有稳定性差及易发生染色体重叠、缺失等特点。该蛋白表达于肥大细胞、软骨细胞、中性粒细胞等骨髓来源的细胞中,于淋巴细胞中未见表达。临床推测,S100 A8 浓度在20～250 mg/L (较高浓度)时,可诱导肿瘤的凋亡,而在<20 mg/L(较低浓度)时可进一步加快肿瘤细胞增殖[13]。S100 A9属于一种神经系统特异性蛋白混合物,多与S100 A8通过钙离子依赖性形式而组成二聚体(四聚体),常于单核-巨噬细胞系、中性粒细胞等中表达,且可抑制酪蛋白激酶的活性[14-15]。本研究结果发现,NSCLC 组血清S100 A8、S100 A9水平均>良性组>健康组,二者预测NSCLC 的AUC均>0.9,诊断价值较高,且S100 A8、S100 A9水平与NSCLC的组织学类型、TNM 分期密切相关,进一步证实S100 A8、S100 A9 蛋白家族参与了NSCLC的发病及进展等病理生理过程。在肿瘤微环境中,S100 A8、S100 A9功能多样且表达具有差异性,可通过多种机制发挥促肿瘤及抗肿瘤的双重作用：(1)抗肿瘤。经线粒体-细胞色素C 旁路途径,S100 A8、S100 A9蛋白复合物可促进抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2 表达下调,诱导线粒体释放Smac/DIABLO 及Omi/Htr A2,进而发挥抗肿瘤效果;经Zn2+与S100 A8、S100 A9 结合,促进细胞内Zn2+含量降低,启动凋亡程序,进而诱导细胞凋亡[16-17]。(2)促肿瘤。S100 A8、S100 A9与迁移能力及细胞活力息息相关,参与肿瘤的转移及浸润过程,且与远端转移灶转移前环境形成相关。S100 A8、S100 A9 可 经RAGE 对JNK 及MAPK信号通路产生作用,促进核因子KB因子激活,进而可加快肿瘤细胞的分裂过程,激活癌基因[18]。髓源性抑制细胞是一群缺乏淋巴系成熟标志的异质细胞,具有免疫抑制功能及多向分化潜能,在肿瘤微环境的免疫抑制细胞中,其执行着负向免疫调控作用,可一定程度上造成免疫抑制,阻碍宿主的积极免疫治疗[19-20]。而S100A8、S100A9 能够促进髓源性抑制细胞的免疫抑制及聚集,进而促进肿瘤的生长及转移。但本研究仍存在一定不足,如纳入病例数较少,未分析S100 A8、S100 A9及MMP-9三者间相关性,未分析不同时间点的血清指标水平等,故后期尚需要开展多中心、大样本、前瞻性研究,以证实本研究结果。

综上所述,NSCLC 患者血清中S100 A8、S100 A9及MMP-9水平均呈高表达,且与组织分化程度、TNM 分期等病理特征密切相关,可作为诊断NSCLC及评估预后的潜在分子标志物。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突