广东地区新型冠状病毒实验室检测专家共识(全文)

2020-11-30广东省科学技术厅新冠肺炎防控指挥办科研攻关组实验室检测协作组

国际呼吸杂志 2020年22期

广东省科学技术厅新冠肺炎防控指挥办科研攻关组实验室检测协作组

自新型冠状病毒疫情暴发以来,截至2020年5月6日8时,全球214个国家和地区出现新型冠状病毒感染病例报道,对全球公共卫生构成巨大威胁。面对疫情的挑战,中国迅速建立了一系列预防控制和医疗救治措施,使国内疫情得到缓解。快速精准的实验室检测在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病因诊断中起着至关重要的作用。为提高对COVID-19 实验室检测方法的认识并总结相关经验,广东省科学技术厅迅速组织广东省内病毒学、临床检验、临床医学、预防医学等专业领域的病毒专家、检验专家及临床医师,总结国内外新型冠状病毒实验室检测技术研究现状,结合广东省一线防治及检测经验,制定适用于实验室检测人员的新型冠状病毒检测共识。本共识涵盖新型冠状病毒病原学、核酸检测、血清学筛查、生物安全防控等方面,并针对检测实际工作中遇到的问题提出建议,以期提高实验室对新型冠状病毒的检测水平,助于控制疫情发展。

1 病原学

新型冠状病毒属于β 冠状病毒亚科Sar becovirus亚属,为单股、正义链RNA 病毒,常为多形性包膜病毒,颗粒呈圆形或椭圆形,直径60～140 n m。新型冠状病毒基因组编码4种主要的结构蛋白,包括刺突蛋白(S)、衣壳蛋白 (N)、膜蛋白 (M)和包膜蛋白 (E)。其基因序列与SARS病毒基因序列相似,可能均起源于蝙蝠。两者S蛋白在一级氨基酸序列上的同源性为87.2%,最小受体结合域的相似性为83.9%,但在基因特征上有明显区别[1]。新型冠状病毒S蛋白介导受体结合和膜融合,由S蛋白上的S1 B 结构域识别宿主细胞表面的血管紧张素酶2受体从而进入细胞。病毒和宿主细胞膜融合后,病毒RNA 在宿主细胞胞浆内进行复制和转录。病毒结构蛋白及新合成的RNA 基因组在内质网及高尔基体进行组装修饰,随后新的子代病毒粒子出芽至内质网/高尔基体中间管腔中,通过囊泡释放[2]。新型冠状病毒的S蛋白结合血管紧张素酶2的亲和力比SARS病毒高约10～20倍,可能有助于新型冠状病毒在人群中的传播[3]。2020年2月11日,国际病毒分类学委员会的冠状病毒研究小组建议把新型冠状病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute repiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2),WHO 将新型冠状病毒肺炎命名为COVID-19。

新型冠状病毒对紫外线及热敏感,通常56 ℃30 min可被灭活。该病毒为包膜病毒,对大部分影响膜的有机溶剂均敏感,包括乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂,但氯已定不能有效灭活病毒[4]。新型冠状病毒可在气溶胶和物体表面保持稳定性长达数小时或数天[5]。

2 实验室诊断方法

依据明确的流行病学接触史、全身症状和肺炎影像学改变等可作出COVID-19 临床诊断,但实验室检测是明确其病原学诊断、发现和排查者的重要依据。常用方法包括病毒核酸检测、血清学检测及一般实验室检测等;标本包括鼻咽拭子、口咽拭子、痰、其他下呼吸道分泌物、血液、粪便、唾液等。由于疾病发展过程中病毒载量、血清学指标等会发生动态变化,如何在特定阶段采取合适的实验室检测方法对临床医师进行COVID-19 确诊至关重要(图1、表1)。

图1 在临床标本中检测新型冠状病毒载量或在血液中检测特定抗体[6]

表1 新型冠状病毒肺炎发展过程中适用的检测方法及标本

2.1 一般检查常规血液检查白细胞计数通常正常或减少,淋巴细胞计数减少(严重者呈现进行性淋巴细胞减少),C-反应蛋白正常或升高,降钙素原在大多数情况下处于正常水平。在严重情况下可能会出现谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和肌红蛋白升高以及D-二聚体水平升高。重型、危重型患者常有IL-6、IL-10 等炎症因子升高[7]。

2.2 核酸检测新型冠状病毒核酸检测可以应用多种分子诊断技术,包括实时荧光PCR、基因测序、等温扩增、POCT 分子诊断系统等 (表2),其中实时荧光PCR 和基因测序被列入国家卫生健康委员会 COVID-19 诊疗规范[4], 是确诊COVID-19的重要病原学证据。各实验室应根据受检对象群体、样品量及具备的条件,选择最适宜的检测技术。目前,应用最广的是实时荧光PCR,也是以下阐述的重点。

2.2.1 试剂选择参考意见 (1)选择包含 “内标”的试剂。“内标”可检测人细胞的序列 (如含有一个单链RNA 分子的RNase P),可以监测标本中是否采集到足够的人体细胞。(2)为提高检测的敏感性,建议选择含至少新型冠状病毒基因的两个位点(开放读码框1a/b、核衣壳蛋白N 或包膜蛋白E)[8],以及核酸模板加样量及扩增反应体系较大的试剂。(3)由于检测试剂对不同基因区域的扩增敏感性可能存在差异,多个靶标间也可能存在相互竞争作用,建议选用引物不同的试剂盒对可疑结果进行复核。

2.2.2 标本前处理 (1)口咽拭子和鼻咽拭子：可直接用于核酸提取,当实验室安全防护条件不充分时可增加病毒灭活步骤[8],但增加病毒灭活步骤可能会降低核酸检测的灵敏度[9]。(2)抗凝血液：1 500×g离心10 min,吸取血浆提取核酸。 (3)肺泡灌洗液和粪便：应充分振荡混匀后进行病毒灭活。(4)痰液：痰液需液化后再提取核酸。痰液标本中如果预加了蛋白酶K,应先在55 ℃孵育15 min后再进行病毒灭活[10]。 (5)病毒灭活：采集标本时,使用含胍盐的病毒灭活保存管可以立即灭活病毒;使用病毒保存液取材的样本则可在恒温箱或水浴箱56 ℃,30～45 min进行灭活[11]。

2.3 核酸提取和加样核酸提取分为手工提取和仪器自动提取两种。手工提取过程繁多,有交叉污染的可能;机器自动提取效率高,对操作人员更安全,建议采用基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法。核酸提取要避免出现核酸气溶胶导致的“假阳性”,可通过喷洒核酸清除剂、75%乙醇喷洒擦拭(不适用于自动提取仪的磁棒)、紫外灯消毒等方法最大程度地减少该环节的污染。

2.4 核酸扩增 (1)安全防护：建议按三级防护要求进行防护,当条件不允许且各工作区分工作业时,扩增区工作人员可按二级防护佩戴防护用品。(2)核酸扩增：将扩增体系放入扩增仪,启动扩增程序。(3)扩增产物处理：将扩增产物用一次性医疗垃圾袋装好扎紧,转移至扩增产物废物处理区。

2.5 结果判断阴性：无Ct值或Ct值为40。阳性：Ct值<37,可报告为阳性。灰区：37≤Ct值≤40,建议重复实验。若重做结果Ct值<40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性(如使用商品化试剂盒,则以厂家提供的说明书为准)。

建议报告方式为“阳性” “阴性”和 “可疑阳性”,应对3种报告方式进行充分的结果解释,并对下一步工作提出建议。

2.6 实验室确诊标准我国国家卫生健康委员会在2020年3月颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中指出[12],实验室确诊阳性病例需满足以下两个条件中的一个：(1)同一份标本中新型冠状病毒2个靶标 (ORF1ab、N)实时荧光PCR 检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果,则需要重新采样,重新检测。如果仍然为单靶标阳性,判定为阳性。(2)同一患者的2种类型标本实时荧光PCR 检测结果同时出现单靶标阳性,或同种类型标本2次采样检测结果均出现单个靶标阳性,可判定为阳性。根据广东省检测工作积累的经验,对于阳性检测结果的判读可参考表3。

表2 各种常用新型冠状病毒核酸检测技术比较

当2个靶标无特异性扩增,可报告 “阴性”。阴性结果可能是病毒载量低于检出限或标本中没有病原体或其核酸存在,建议应结合临床症状、影像学检查及实验室检查进行综合诊断,以防漏诊误诊。当临床体征及其他检查提示高度怀疑新型冠状病毒感染时,建议对整个检测环节 (如样本的采集、流转及处理等环节)进行综合分析,不排除新型冠状病毒早期感染、复发感染或合并其他呼吸道病毒感染等。如条件允许,建议采集深咳痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的样本进行复测。

2.7 质量控制

2.7.1 规范的临床核酸检测实验室合理的实验室分区、接受过培训的检测人员、合理的操作流程和严格的质量管理体系。

2.7.2 标本采集的时机和部位疑似感染患者在不同的疾病期、不同部位的标本,病毒浓度会有差异。采集多个部位的标本进行检测,可以提高检出率。病毒必须在细胞内才能复制,因此,采集到含有病毒的细胞是避免“假阴性”的重要环节之一。

2.7.3 标本采集标本采集人员应熟练掌握采集方法。采集拭子标本时,须采集到含有人体细胞的标本。含“内标”的扩增试剂,可以监控取材是否合格。

2.7.4 标本运输标本采集后,置于含病毒保存液或样本保存液 (含病毒裂解液)的专用运送管中,在4～6 ℃状态下保存并尽快运输送检,以降低运输过程中病毒核酸RNA 的降解。

2.7.5 标本接收与处理标本接收后应及时处理,特别是痰液。因为如果标本中加入了痰液消化液,操作时间延长将导致核酸的降解。

2.7.6 质控品的使用试剂盒中配有阳性质控品/对照品。也可将阳性样本的核酸分装冻存,用作阳性对照以验证试剂的有效性。实验室条件允许的情况下,可将阳性标本灭活并经考核以后作为阳性质控品使用,阳性质控品应选用弱阳性的标本。

2.7.7 设置充分的对照对照包括试剂对照、阴性对照和阳性对照。建议新型冠状病毒检测每批次设立1个弱阳性质控、3个阴性质控。3个阴性质控随机放在临床样本中间。弱阳性质控检测结果为阳性,3份阴性质控全部测定为阴性,视为在控;反之为失控。应仔细分析原因,必要时重新检测。

2.7.8 试剂的检测性能确认用已知的阴性和阳性样本核酸对每批次试剂进行质检,可以确保检测试剂的质量。试剂存在 “检测下限”,样品中病毒数量低于检测下限时,试剂将无法检出。

3 血清学检查

3.1 标本类型及送检要求新型冠状病毒特异性抗体检测可采用全血 (包括末梢血)、血清或血浆标本。应注意已有研究表明血清56℃30 min灭活会影响新型冠状病毒特异性抗体检测结果,尤其对Ig M 抗体检测结果影响更大[13]。新型冠状病毒抗原在血液中的检出率尚不明确,必要时可采用尿液、(鼻)咽拭子、痰液、粪便等其他标本进行检测[14]。样本采集包装后使用专用运输箱及运输罐,尽快将样本转运至实验室。配送调度相关部门组织专人登记、审核和配送,同时需要专箱专用。

表3 新型冠状病毒核酸检测结果判读

3.2 检测原理新型冠状病毒血清学检测常见方法包括胶体金免疫层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定以及化学发光法[15-16]。从方法学角度而言,荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定以及化学发光法检测敏感度相对较高,可提供半定量或定量的检测结果用于跟踪抗体浓度动态变化,但需配备相应的检测仪器。胶体金免疫层析法通过肉眼判断结果即可,简便快速但敏感度相对较低,仅能提供定性结果。各检测方法的比较见表4。

3.3 结果解释新型冠状病毒血清学检测包括抗原和抗体检测,其中特异性抗体Ig M、Ig G 检测已纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案 (试行第八版)》实验室检查部分[4]。新型冠状病毒特异性Ig M 抗体或Ig G 抗体阳性;血清特异性Ig G 抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4倍及以上升高可作为疑似病例的确诊条件之一。对于已确诊的患者,可通过动态监测新型冠状病毒抗原与抗体的滴度变化评估疗效和疾病转归。此外,新型冠状病毒特异性抗体的检测也可应用于人群感染的回顾性流行病学调查。值得注意的是,基于抗原抗体结合的免疫学检测方法的局限性,标本中的类风湿因子、嗜异性抗体、溶血、纤维蛋白以及其他类型冠状病毒的抗原交叉反应可导致检测结果呈假阳性[17-18]。因此,血清学检测结果不能作为新型冠状病毒感染的独立确诊依据,需结合患者临床症状、暴露史、其它实验室检查结果及影像学检查进行综合判断。特异性Ig M 抗体和Ig G 抗体检测结果解读见表5。

3.4 质量控制使用中国国家药品监督管理局批准的试剂盒进行质量控制。实验室开展检测工作之前根据试剂说明的性能参数 (如符合率、精密度、正确度等)进行相关性能验证。当室间质评机构能提供相应质控物时,应参加室间质量评价,或与开展相同检测方法的其它实验室进行室间比对。

定性试验：每批次检测时,建议使用阴性和阳性质控品进行质控,推荐使用外部质控,阳性结果至少包括检测值接近临界值的质控品。阳性对照结果呈阳性,阴性对照结果呈阴性,则认为该批次有效。定量试验：每天使用前或重新定标后,应使用检测试剂盒配套质控品或其他三方质控品进行质控,至少包含2个浓度水平。

表4 新型冠状病毒血清学检测常用检测方法比较

表5 新型冠状病毒特异Ig M 和Ig G 抗体检测结果解读

4 病毒分离与鉴定

4.1 病毒分离可从人呼吸道样本中分离出新型冠状病毒,但无法在一般实验室中开展,不推荐作为常规诊断过程[19]。在生物安全三级实验室中,将口/鼻咽拭子、嗽口液、鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物、肺活检材料、尸检组织等标本进行相应的前处理。取200μl待检标本接种于Vero-E6或人小型气道上皮细胞培养管,于36 ℃培养箱吸附4 h,15 min轻摇一次。200μl PBS洗涤细胞1次,加1 ml维持液继续培养。待大部分细胞从边缘出现病变 (判断标准见表6)及不规则形态,细胞内颗粒增多,细胞圆缩、脱落,而正常对照细胞形态良好,此时将培养细胞收集待鉴定。

表6 细胞病变结果判定

4.2 病毒鉴定采用荧光定量PCR、RT-PCR、间接免疫荧光法或电镜观察鉴定。新型冠状病毒感染Vero-E6细胞于36 ℃培养箱吸附1 h后继续培养48 h,刮取具有明显病变感染细胞,775×g,10 min 4 ℃离心,吸去上清,加入1.5 ml 2.5%戊二醛与4%多聚甲醛混合固定,4 ℃固定2 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3 次,1%锇酸固定,梯度乙醇脱水,利用包埋模具、Epon812纯树脂包埋,常规超薄切片 (70 n m),醋酸铀-柠檬酸铅双染色,透射电镜观察(图2、图3)。

5 生物安全及废弃物处理

新型冠状病毒已被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病,但按照甲类传染病的预防、控制措施。对新型冠状病毒的标本采集、检测、包装和运输、废弃物销毁等过程进行如下生物安全防护。

5.1 标本采集的生物安全要求[12](1)标本采集人员应经过生物安全培训,且培训合格。(2)采样人员个人防护装备要求生物安全三级个人防护。接触了患者血液、体液、分泌物和排泄物,应及时更换外层乳胶手套。(3)必要时可加穿防水围裙或防水隔离衣。标本采集后,运输前尽可能对容器外壁做好消毒。 (4)标本的临时保存：24 h内检测的标本可置于4 ℃保存。需长期保存的标本应在-70 ℃及以下保存,标本避免反复冻融。

图2 从新型冠状病毒咽拭子样本中分离出病毒阳性的Vero-E6细胞的超薄切片电镜图片 (广州医科大学附属第一医院杨子峰提供) A：细胞胞浆内及细胞膜外、细胞突起之间可见大量的病毒颗粒,囊泡内壁附着成熟的病毒粒子 (Bar=500 n m,×50 000);B：细胞胞浆内外及细胞外突起之间都黏附着大量成熟的病毒粒子 (Bar=500 n m,×30 000)

图3 新型冠状病毒阳性患者的肺泡灌洗液经离心超薄切片后的电镜图像 (广州医科大学附属第一医院杨子峰提供),可见细胞中有明显的板层小体,判断为Ⅱ型肺泡上皮细胞。细胞中大量囊泡内富集着大量病毒粒子 (Bar=200 n m,×50 000)

5.2 标本开展实验活动的生物安全要求[20](1)标本检测人员应经过生物安全培训,且培训合格。(2)标本分装：标本采集后在生物安全二级实验室的生物安全柜内分装。未灭活标本的分装人员需采取个人生物安全三级防护要求。(3)未经培养的感染性材料的操作：应当在生物安全二级实验室进行,同时采用生物安全三级实验室的个人防护。(4)病毒培养：应当在生物安全三级实验室进行。病毒培养物加入裂解剂或灭活剂后可参照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。(5)灭活材料的操作：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后,应当在生物安全二级实验室进行检测。

5.3 标本运输和包装的生物安全要求[20]

5.3.1 国内运输包装分类新型冠状病毒毒株或其它潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类,对应的联合国编号为UN2814,包装符合国际民航组织文件Doc9284 《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求。该材料运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌 (毒)种或样本运输管理规定》 (原卫生部令第45号)办理《准运证书》,如果在固定的申请单位和接收单位之间多次运输相同品种高致病性病原微生物菌 (毒)种或样本的,可以申请多次运输。

5.3.2 国内运输要求标本采集后,按照A 类感染性物质的包装 (图4),即三层包装：主容器(防水、密封、防泄漏,如装标本的试管等)、辅助容器(防水、耐95 k Pa的压力、无渗漏,如塑料罐等)和外包装(在辅助容器外的保护层,具有足够的强度,如运输箱或一次性运输包装等)对标本进行包装后,由经过生物安全培训并培训合格的至少两名专业人员乘坐配有生物危害物质溢出紧急处理箱的专车运送。如需长途运输的,标本需置干冰中运输。

图4 A 类感染性物质的包装

5.3.3 国际运输在国际间运输的新型冠状病毒标本或毒株应规范包装,按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续,并满足相关国家和国际要求。

5.3.4 单位内运输新型冠状病毒的呼吸道和血液样本采集后应尽快送往实验室。为了避免意外泄漏或溢出,可将标本固定在试管架上,使装有标本的容器保持直立,并用密封的专用盒、专用运输箱及运输罐等二级容器运输标本。密封口最好有一个垫圈,要定期清除污染。二级容器可以是金属或塑料制品,可耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的作用。采样、运输和接收部门组织需设专人登记、审核和运输。

5.4 标本和毒株管理[12,20](1)新型冠状病毒毒株及其样本应由专人管理,设立专库或专柜单独保存标本。 (2)准确记录毒株和样本的来源、种类、数量,编号登记,采取有效措施确保毒株和样本的安全,严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。(3)无保存资质的单位,完成检测后应在一周内将阳性标本送交有保存资质的单位或按规定开展复核检测的单位。如果无需上送,应在一周内销毁。 (4)新型冠状病毒监测期间,可设立有保存条件的各级疾控中心和有生物安全三级实验室的单位为临时保存单位。其他单位如因有科研项目或实验任务,需要临时保存和使用新型冠状病毒生物样本,可向当地分管生物安全的行政部门提出申请。

5.5 废弃物的处理[21](1)在生物安全柜中操作时,应在生物安全柜内脱除怀疑被污染的手套并丢弃在生物安全柜内的医疗垃圾袋中。(2)生物安全柜中装医疗废弃物的垃圾袋用密封袋转移到黄色医疗垃圾袋前,须在密封袋封口处内外喷75%乙醇或有效氯500～1 000 mg/L 的含氯消毒剂。黄色医疗垃圾袋在移出生物安全柜前,在封口处和垃圾袋外面喷75%乙醇或有效氯500～1 000 mg/L的含氯消毒剂。(3)操作中如产生迸溅或泄漏,必须通过消毒达到对病原微生物的杀灭。(4)实验室操作过程中产生的所有废弃物均须经121 ℃30 min压力蒸汽灭菌,同时设置高压效果指示物,高压灭菌后按普通废弃物处理。

6 小结与展望

新型冠状病毒在全球范围持续蔓延。本共识聚焦新型冠状病毒实验室检测的重大需求,立足国家最新颁布的COVID-19 诊断标准及国际最新研究进展,利用广东省科学技术厅新冠肺炎防控指挥办科研攻关组成员在临床诊疗领域中的丰富经验交叉应用,相互印证,尤其是围绕不同检测手段结果不一致的问题,更突出本共识的实用性及前沿性,为不同层级新型冠状病毒肺炎临床科室带来了诊断结果的启示。同时,伴随新型冠状病毒相关诊断产品及检测手段不断发展,实验室检测专家共识编写组也将继续致力于COVID-19新型诊断技术的应用,及时对本共识进行补充或修订,以满足各级检验人员对COVID-19 实验室诊断检测技术的需求,以便提高检测能力及结果判断水平,尽早发现传染源,有效控制疫情蔓延。

编写组成员

(按姓氏汉语拼音排序,排名不分先后)

陈翊 (广州市妇女儿童医疗中心)

杜秋伶 (广州医科大学附属第一医院)

关文达 (广州医科大学附属第一医院)

黄吉城 (广州海关技术中心)

刘勇 (广州金域医学检验中心)

任健康 (广州金域医学检验中心)

松阳洲 (中山大学)

武婕 (广东省疾病预防控制中心)

杨子峰 (广州医科大学附属第一医院)

叶枫 (广州医科大学附属第一医院)