SSBP1在肺腺癌中的表达及对A549细胞增殖的影响

2020-11-30张亚娟高习文吴福红

国际呼吸杂志 2020年22期

张亚娟高习文吴福红

1复旦大学附属闵行医院呼吸与危重症医学科,上海201199;2上海市第六人民医院金山分院血液肿瘤科201599

肺癌是目前全球发病率最高、致死率最高的男性和女性恶性肿瘤。根据2018年全球癌症统计报告,肺癌占全部肿瘤发病率的11.6%,占全部肿瘤死亡率的18.4%[1]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌约占85%以上。非小细胞肺癌的病理类型主要分为腺癌和鳞癌。肺腺癌约占肺部肿瘤的40%,其最重要的风险因素是吸烟[2]。目前,手术切除、放射治疗及化学治疗仍是肺腺癌最常见的治疗方法,但疗效并不理想,患者5 年生存率仅为15%[1,3]。因此,发现新的肺癌分子标志物有助于肺腺癌的早期诊断、靶向治疗和预防。

线粒体单链DNA 结合蛋白1 (mitochondrial single-strand binding pr otein 1,SSBP1)是线粒体DNA 合成的关键分子,调控线粒体DNA 复制、修复和转录,影响线粒体的生物学功能,调节细胞的多种生理功能[4]。目前发现SSBP1与恶性肿瘤的发生、发展和转移等密切相关[5-8],但SSBP1在肺癌中的表达情况及其生物学功能尚不清楚。本研究探索SSBP1在肺癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 DMEM 培养基购自美国Hy Clone公司;胎牛血清购自美国Gibco 公司;Opti-MEM 培养基及Lipofecta mine 2000购自美国Life Technologies 公司;CCK8 试剂盒购自美国Selleck 公司;SSBP1 兔多克隆抗体购自美国Proteintech 公司,兔抗人p-Akt和兔抗人Akt购自美国CST 公司,Actin 抗体购自美国sig maal drich公司。其它试剂均为国产分析纯。

1.1.2 数据来源数据均来源于TCGA 数据库,包括肺腺癌和肺鳞癌数据集的mRNA 表达数据以及对应的临床资料数据。临床资料包括生存时间、生存状态和疾病分期等。

1.2 方法

1.2.1 基因表达分析利用GEPIA 对TCGA 数据分析SSBP1 mRNA 的表达水平与肺癌患者分期和预后的关系。共分析483例肺腺癌组织及59例癌旁组织,486例肺鳞癌组织及50例癌旁组织。

1.2.2 p LVTH M-sh RNA SSBP1质粒构建将质粒载体p LVTHM 进行Ml UⅠ和ClaⅠ双酶切反应,DNA 纯化回收试剂盒回收p LVTH M 片段,与合成的MRPL13靶序列退火产物连接,敲低SSBP1的靶序列为AGTTTGGTTCTTGAAAGAT,连接产物与100μl的DH5α感受态细菌混匀后转化,挑取单克隆测序。

1.2.3 细胞培养 HEK293T 和人肺腺癌细胞株A549细胞置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱、RPMI 1640 完全培养基 (含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)中培养。

1.2.4 病毒包装与感染 0.25% 胰酶消化HEK293 T 细胞,接种10 c m 培养皿,待细胞密度达到90%时,细胞培养基换成无血清的培养基。含有12μg目的质粒、3.6μg的p MD2 G 和9μg的ps PAX2病毒包装辅助质粒与不含血清的培养基混合,与含有60μl Lipofecta mine T M 2000的脂质体混合液混合,加入HEK293T 细胞中,37 ℃培养6～8 h后,更换含有血清的RPMI1640 培养基。48 h后收集细胞上清液,细胞上清液与完全培养基1∶1 混合加入细胞融合度为60%的平皿中,并加入0.1%的凝聚胺,37 ℃培养6～8 h后换新鲜的RPMI1640完全培养基,37 ℃培养48 h后检测感染效率。

1.2.5 q RT-PCR 根据NCBI上公布的各基因序列分别设计q RT-PCR 用引物。SSBP1 正向引物：5'-TGGAGTCGTGTGTTTTGGCT-3', 反向引物： 5'-TAGGCTTTTCCTGAAAACCGAGG-3';GAPDH 正向引物：5'-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3',反向引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';并由上海生物工程有限公司代为合成。Trizol法提取细胞中的总RNA,按试剂盒说明书操作。根据Takara逆转录试剂盒进行逆转录反应,生成c DNA。进行PCR 反应。各基因对应正、反向引物各0.5 μl,SYBR Green Mix 10μl,c DNA 模板1.0μl,灭菌双蒸水8μl。PCR反应程序：95 ℃3 min;95 ℃5 s,56 ℃30 s,72 ℃25 s,35个循环;65 ℃5 min;95 ℃50 s,选取GAPDH 为内参基因。采用2-ΔΔCT表示各基因的相对表达量。

1.2.6 蛋白质印迹法收集细胞,使用RIPA 细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)裂解细胞,4 ℃裂解30 min,12 000×g离心15 min,吸取上清,BCA 法检测浓度,加上样缓冲液,100 ℃水浴煮5 min,分装后置于-80 ℃中。用10%SDS-PAGE凝胶分离蛋白质,之后转印至PVDF膜,5%BSA 封闭2 h。膜与特定的一抗在4 ℃孵育过夜 (MRPL13,1∶400 稀释)。TBST 洗膜3 次,每次10 min。加入相应的二抗(1∶5 000稀释)后在37 ℃孵育1 h。用TBST 洗膜3次,每次10 min。采用化学发光法检测信号。

1.2.7 克隆平板实验细胞接种于6孔板中,每皿2 000个,37℃、5%CO2的培养箱中培养10 d,弃去培养基,用多聚甲醛固定后,吉姆萨染色、相机拍照、计数。实验重复3次。

1.2.8 CCK8实验按104/孔的密度将细胞种于96孔板中,24 h 细胞贴壁后,加入10μl CCK-8溶液,37 ℃避光孵育1 h,检测450 n m 吸光度,根据吸光度值绘制生长曲线。实验重复3次。

1.3 统计学分析采用SPSS 17.0和GraphPad Prism6对各实验结果进行统计学分析。计量数据以±s表示,组内比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SSBP1 mRNA 在肺癌中的表达水平通过分析TCGA 数据库(483例肺腺癌组织及59例癌旁组织,486例肺鳞癌组织及50例癌旁组织)发现,SSBP1 mRNA 的表达水平在肺腺癌、肺鳞癌组织中均明显高于癌旁组织(P值均<0.05),见图1。

图1 SSBP1 mRNA 在肺癌组织和癌旁组织中的表达水平 A：SSBP1 mRNA 在肺腺癌组织和癌旁组织中的表达水平;B：SSBP1 mRNA 在肺鳞癌组织和癌旁组织中的表达水平

2.2 SSBP1 mRNA 的表达水平与肺癌患者组织分期的关系根据TCGA 数据库,SSBP1 mRNA 的表达水平随着肺腺癌分期的增加而增加,差异有统计学意义(F=7.52,P<0.01);不同分期肺鳞癌的SSBP1 mRNA 表达水平差异无统计学意义(F=1.07,P=0.36),见图2。

2.3 SSBP1 mRNA 的表达水平与肺腺癌患者预后的关系为了探讨SSBP1对于肺腺癌患者预后的影响,采用TCGA 数据库进行分析。根据SSBP1 mRNA 的表达水平,肺癌患者分成低表达组 (低于平均值)和高表达组 (高于平均值)。结果显示高表达组肺腺癌患者总生存率和无病生存率均较低表达组缩短,差异均有统计学意义 (P值均<0.05)。但是,2组肺鳞癌患者总生存率和无病生存率比较,差异均无统计学意义 (P值均>0.05)。见图3。

2.4 阴性对照组与SSBP1敲低组抑制A549的增殖和克隆形成能力的比较为了揭示SSBP1对肺腺癌细胞增殖的影响,我们通过慢病毒感染构建了稳定敲低SSBP1 的A549 细胞系,细胞被分成SSBP1敲低组和阴性对照组。通过CCK8 实验和平板克隆实验结果显示,SSBP1敲低组A549细胞增殖和克隆形成能力均低于阴性对照组,差异有统计学意义 (t=13.91、15.19,P值均<0.01)。见图4。

图2 SSBP1 mRNA 在肺癌不同分期组织中的表达水平 A：肺腺癌;B：肺鳞癌

2.5 阴性对照组与SSBP1敲低组Akt磷酸化水平比较为了进一步研究SSBP1对A549细胞增殖的影响,我们检测了Akt的磷酸化水平,结果显示SSBP1敲低后Akt的磷酸化水平显著降低 (t=17.88,P=0.003),见图5。

2.6 SSBP1 mRNA 与Ki67 mRNA 在肺腺癌组织中的相关性 Ki67为细胞增殖的标志物。为了进一步研究SSBP1对肺腺癌细胞增殖的影响,我们通过TCGA 数据库分析肺腺癌组织中SSBP1 mRNA 与Ki67 mRNA 的相关性,结果发现SSBP1 mRNA 的表达水平与Ki67 mRNA 的表达水平呈正相关性(r=0.39,P<0.01),见图6。

3 讨论

线粒体是真核生物体内重要的细胞器,处于能量转换和新陈代谢的中心位置,在生命活动中发挥重要作用。近年来,线粒体功能异常与肿瘤的关系受到越来越多的关系。目前人类基因组中发现3种单链DNA 结合蛋白(SSB1、SSB2和SSBP1),其中人SSBP1基因特性定位于线粒体,其结构高度保守,包括4个外显子和3个内含子。SSBP1是线粒体DNA 合成的关键分子,主要参与线粒体DNA 的复制、转录、损伤后修复过程。SSBP1表达异常将直接导致线粒体DNA 拷贝数异常或基因突变,最终造成恶性肿瘤的发生、发展。

图3 SSBP1 mRNA 表达量与肺癌患者总生存率和无病生存率的关系 A：SSBP1 mRNA 表达量与肺腺癌患者总生存率的关系;B：SSBP1 mRNA 表达量与肺鳞癌患者总生存率的关系;C：SSBP1 mRNA 表达量与肺腺癌患者无病生存率的关系;D：SSBP1 mRNA 表达量与肺鳞癌患者无病生存率的关系

图4 阴性对照组与SSBP1敲低组A549的增殖情况比较 A：2组SSBP1 mRNA 相对表达量的比较;B：2组细胞增殖情况比较;C：2组细胞克隆形成能力的比较吉姆萨染色 ×200

SSBP1的表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明,SSBP1 在结肠癌中表达增加,敲低SSBP1 的表达影响线粒体质量诱导细胞凋亡[6]。针对胃癌SSBP1单核苷酸多态性的研究结果表明,SSBP1-rs6976500是一个独立的预后标志物,可改善目前胃癌TNM 分期系统的预后预测[5]。在胃癌中SSBP1 的表达增高,与TNM 分期和肿瘤浸润密切相关[9]。有报道炎症因子IL-6可上调SSBP1的表达,增加的SSBP1可促进线粒体的生物合成,诱导端粒酶逆转录酶的表达,促进结肠癌细胞增殖[8]。在肝癌中SSBP1的表达与肿瘤数量、肿瘤大小、门静脉癌栓和肿瘤分级具有显著的相关性,SSBP1高表达患者预后较差[10]。但SSBP1在三阴性乳腺癌转移的组织中表达降低,且通过TGFβ-SMAD 通路抑制乳腺癌转移[5]。Wang等[11]研究显示,敲低SSBP1的表达能增强肺癌H1299细胞的放射敏感性,诱导肺癌H1299细胞阻滞于G2/M 期。这些结果说明SSBP1在不同的肿瘤中可能发挥不同的作用。本研究中,我们通过TCGA 数据库发现SSBP1 mRNA 在肺腺癌组织中表达明显增高,而且SSBP1 mRNA 的表达水平与患者的临床分期和预后不良密切相关,高表达SSBP1 mRNA 的肺腺癌患者的总体生存率和无病生存率显著降低,提示SSBP1可能作为判断肺腺癌患者预后的新型分子标志物。

图5 阴性对照组与SSBP1敲低组Akt磷酸化水平比较

为了证明SSBP1 在肺腺癌中的生物学功能,我们通过慢病毒构建了稳定SSBP1敲低的A549细胞,结果显示敲低SSBP1能抑制A549细胞的增殖和克隆形成。Akt信号通路的异常激活与肿瘤的发生、发展密切相关,该通路调节细胞增殖、迁移和转移等,Akt是多种肿瘤的治疗靶点[12-13]。本研究结果显示,敲低SSBP1的表达降低A549细胞Akt的磷酸化水平,提示SSBP1可能通过Akt通路促进A549细胞增殖。我们也发现SSBP1的表达水平与作为细胞增殖标志物的Ki67的表达呈明显的正相关性。p21和p53 是Akt信号通路重要的靶蛋白。有研究显示,SSBP1 能与p21 在肝癌细胞中相互作用,阻止p21免受泛素化的降解,影响细胞周期的转换[14]。SSBP1 也可与p53 相互作用,保护p53 免受泛素-蛋白酶体通路的降解,敲低SSBP1的表达导致细胞周期G2/M 期阻滞依赖于p53或p300[15]。最近的研究显示,SSBP1 在结肠癌中表达增高,SSBP1可通过Akt/mTOR 通路有利于结肠癌细胞增殖[8]。这些结果提示,SSBP1可能通过调控Akt进而影响p21、p53 或mTOR的表达影响肺腺癌细胞增殖,SSBP1 可能是肺腺癌治疗的重要分子靶标。