凉血消银颗粒剂对银屑病转基因小鼠模型miR-155/SOCS1轴的影响

段紫钰，李建国，陈静，刘鸿伟，李丽娜，周武，张守民

银屑病俗称牛皮癣，中医学称之为白疕，临床表现为真皮炎性反应、皮肤异常增殖、肉眼可见的红斑脱屑等症状［1］。银屑病一般多发于青壮年，全身各部位均可发病，具有病程长、易复发、治愈难等特点［2］。凉血消银颗粒剂具有清热凉血、活血化瘀、通络、抗肿瘤、抗菌抗炎、增强免疫活性、抑制银屑病表皮细胞增殖的功效［3］，但是其治疗银屑病的作用机制尚不明确。微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）/细胞因子信号转导抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）通路在多种疾病中发挥重要作用，miR-155与人体免疫系统有关，研究发现miR-155在B细胞、T细胞、树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞的细胞增殖、炎症反应中起促进作用［4］。SOCS1是miR-155重要的靶基因，能够负向调控Janus激酶（Janus kinase，Jak）/信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路［5-7］。凉血消银颗粒剂能否通过调节miR-155/SOCS1轴以缓解银屑病症状尚少见报道。本研究拟通过测定凉血消银颗粒剂对转基因银屑病小鼠miR-155、SOCS1、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-23、IL-6、IL-1表达水平的影响，探究其治疗银屑病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器凉血消银颗粒剂的组成成分为：紫草15 g、赤芍10 g、白花蛇舌草15 g、生地20 g、槐花15 g、丹参15 g、水牛角15 g、白茅根10 g、鸡血藤15 g、丹皮10 g、熟地20 g，为我院中药自制剂；甲氨蝶呤（＞98%）购自上海源叶生物科技有限公司，批号S18026；TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号E-EL-M0049c、E-EL-M0731c、EEL-M0044c、E-EL-M0038c；总RNA提取试剂盒购自北京金克隆生物科技有限公司，批号EX1882-50T；miR-155引物及内参U6引物序列由北京安必奇生物科技有限公司合成；兔抗鼠SOCS1、兔抗鼠内参β-actin、羊抗兔二抗均购自美国Bioworld公司，批号AC6015、AC5113、AC5719。电泳槽和转膜槽购自美国Bio-Rad公司；奥林巴斯CX33显微镜购自日本奥林巴斯公司；Evolution 200紫外-可见分光光度计购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验动物与分组K14-VEGF转基因小鼠（银屑病模型，SPF级）24只，按随机数表法分为模型组、凉血消银颗粒剂组和甲氨蝶呤组，每组8只；未经任何处理的远交系Swiss小鼠（FVB/NJ）8只（对照组），均购自郑州大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（豫）2017-0001，实验动物使用许可证号SYXK（豫）2017-0012，动物质量合格证号2018030912，全部小鼠雌雄各半，体质量约25 g。随机分笼饲养动物，标准饲料喂养并自由饮水，每隔3 d更换垫料，温度设置为25℃，湿度（60±10）%。凉血消银颗粒剂给药时用生理盐水稀释，以60 g/kg剂量灌胃给药（成人剂量的20倍），每日1次［3］；甲氨蝶呤以2 mg/kg剂量灌胃给药，每日1次［8］；对照组、模型组每天灌胃等体积的生理盐水。

1.3 实验动物取材各组小鼠给药10 d在1%戊巴比妥钠0.06 mL/g腹腔麻醉后，鼠尾采血，25℃静置20 min后，5 000 r/min离心30 min，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存。脱颈处死后立即剪取相应受损处皮肤组织，转移至-80℃冰箱储存。

1.4 凉血消银颗粒剂治疗效果评价用严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）评分评价凉血消银颗粒剂的治疗效果。使用照相机对各组小鼠同一病损皮肤部位进行拍照观察，按照PASI评分标准对小鼠进行评分，PASI评分标准［9］：对小鼠病损皮肤部位的浸润厚度、红斑、鳞屑情况分别进行0～4分赋值，小鼠的皮肤病损情况越严重，分值越高。

1.5 HE染色评价病理严重程度将固定后的各组小鼠受损皮肤组织石蜡包埋，切片（3μm左右）。将切片用二甲苯常规脱蜡，将脱蜡后的切片依次用二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水洗脱，然后脱水。苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化30 s，50℃温水浸泡5 min，然后脱水。伊红染色2 min，脱水、透明、中性树胶封片，置于显微镜下观察并拍照。

1.6 ELISA法检测小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平严格按照ELISA试剂盒说明书操作，显色后，用多功能酶标仪测定样品在450 nm处的吸光度（A），根据标准曲线计算TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1水平。

1.7 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）检测miR-155表达水平严格按照说明书提取皮肤组织总mRNA，使用紫外分光光度计测定mRNA在260/280 nm处紫外吸光度值，A260/280＞1.8表明纯度合格，置于-80℃冰箱储存备用。miR-155引物序列：上游5′-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3′，下 游5′-ACCCCTATCACAATTAGCATTAA-3′；内 参U6上 游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。qPCR反应体系20μL，其中SYBRPremix ExTaqTMⅡ10μL，cDNA 2 μL，Rox Re-ference DyeⅡ（50×）0.4μL，miR-155上、下游引物各0.8μL，ddH2O 6μL。采用两步法，每个样本均做6个复孔，反应条件：95℃预变性30 s；94℃变性30 s，65℃退火30 s，75℃延伸15 s，40个循环；75℃终末延伸5 min。采用2-ΔΔCt法对miR-155水平定量分析。

1.8 蛋白质印迹法（Western blot）测定SOCS1蛋白表达水平从-80℃冰箱中取出待测样品，加入200μL裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟），匀浆至无组织碎块，离心取上清。严格按照BCA试剂盒说明书测定总蛋白含量，每组设置6个复孔。加入样品1/4体积的5×Loading buffer，加热至100℃，持续5 min。稳压电泳（100 V），至样品进入分离胶，加大电压至120 V，直至Loading buffer到达分离胶底部。湿法转膜，5%BSA室温封闭1 h。加入兔抗鼠SOCS1、兔抗鼠内参β-actin，稀释比例均为1∶1 000，4℃孵育过夜，用PBS清洗，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育，PBS清洗，用显色剂显色、曝光。用凝胶成像设备观察。

1.9 统计学方法使用SPSS 22.0版软件对数据进行统计分析。计数资料以例（%）表示，行χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）形式表示，多组比较行单因素方差分析，多重比较行SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 凉血消银颗粒剂治疗后PASI评分对比4组间PASI评分比较差异有统计学意义（F=68.062，P＜0.01，n=8）。与对照组（0）相比，模型组PASI评分显著升高（3.25±0.26，P＜0.05）；与模型组相比，凉血消银颗粒剂组（2.13±0.24）、甲氨蝶呤组（1.88±0.25）PASI评分显著降低（P＜0.05）；后两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 凉血消银颗粒剂治疗后HE染色结果对照组基底层细胞保持完整，血管周围及真皮浅层未见炎症细胞浸润；模型组表现为棘层增厚、表皮突下延、角化过度伴角化不全、真皮浅层淋巴细胞浸润，基本符合银屑病病理特征；凉血消银颗粒剂组和甲氨蝶呤组小鼠病理严重程度显著降低，细胞形态有所恢复，见图1。

Fig.1 HE staining results after treatment with Liangxue Xiaoyin granule in four groups(×200)图1凉血消银颗粒剂治疗后各组HE染色结果（×200）

2.3 各组小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平与对照组相比，模型组TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，凉血消银颗粒剂组、甲氨蝶呤组TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平显著降低（P＜0.05）；凉血消银颗粒剂组与甲氨蝶呤组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of serum TNF-α,IL-23,IL-6 and IL-1 after treatment between four groups表1治疗后各组小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平比较 （n=8，ng/L，±s）

Tab.1 Comparison of the expression levels of serum TNF-α,IL-23,IL-6 and IL-1 after treatment between four groups表1治疗后各组小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平比较 （n=8，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组凉血消银颗粒剂组甲氨蝶呤组F TNF-α 87.29±12.34 164.65±14.07a 113.29±11.19ab IL-23 85.39±8.41 181.94±17.62a 114.87±15.93ab IL-6 55.95±15.26 126.82±17.95a 75.33±14.42b IL-1 35.97±8.14 81.49±10.26a 64.77±10.39ab 108.13±8.97ab 62.138＊＊122.08±10.94ab 69.510＊＊73.18±13.91b 31.304＊＊60.08±10.45ab 29.109＊＊

2.4 治疗后小鼠受损皮肤组织中miR-155、SOCS1表达水平与对照组相比，模型组miR-155表达水平显著升高，SOCS1表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，凉血消银颗粒剂组、甲氨蝶呤组miR-155表达水平显著降低，SOCS1表达水平显著升高（P＜0.05）；后两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表2。

Fig.2 The expression of SOCS1 in the damaged skin tissue detected by Western blot assay in four groups图2 Western blot检测各组小鼠受损皮肤组织中SOCS1表达水平

Tab.2 Comparison of miR-155 and SOCS1 expression levels in damaged skin tissues after treatment between four groups表2治疗后各组小鼠受损皮肤组织中miR-155、SOCS1表达水平比较 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of miR-155 and SOCS1 expression levels in damaged skin tissues after treatment between four groups表2治疗后各组小鼠受损皮肤组织中miR-155、SOCS1表达水平比较 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组凉血消银颗粒剂组甲氨蝶呤组F miR-155/U6 1.09±0.34 1.84±0.43a 1.36±0.22b 1.33±0.19b 8.204＊＊SOCS1/β-actin 0.80±0.21 0.28±0.06a 0.47±0.09ab 0.46±0.11ab 22.131＊＊

3 讨论

3.1 凉血消银颗粒剂治疗银屑病的研究现状银屑病病因复杂，其与感染、遗传、代谢、环境、免疫功能、精神和内分泌因素等有关［10］。甲氨蝶呤是临床上治疗银屑病的常用药，主要针对症状进行治疗，可减缓患者临床表现，但是在用药过程中存在并发症［11］。

中医理论认为，银屑病患者化燥生风、营血亏损、肌肤失养、血热内蕴等引起，反映在患者的肌肤中就是血瘀、血燥、血热［12］。从血论治是中医界较为认可的治疗银屑病一种观点，凉血消银颗粒剂以生地为君药，具有清热凉血、养阴生津的作用，水牛角、槐花、紫草为臣药以增强清热凉血功效［13］。曹丽楠［14］研究发现凉血消银汤能够改善进行期银屑病患者临床症状，降低血清中IL-1、IL-6、TNF-α表达水平，提高临床疗效。孙涛［3］发现凉血消银颗粒治疗的银屑病患者有效率高，2年复发率低，提示使用凉血消银颗粒治疗临床效果好，能降低复发率。本研究发现，与对照组相比，模型组PASI评分显著升高，棘层增厚、表皮突下延、角化过度伴角化不全、真皮浅层淋巴细胞浸润，即提示浸润厚度、红斑、鳞屑加重，证明模型制备成功。与模型组相比，凉血消银颗粒剂组、甲氨蝶呤组PASI评分显著降低，病理严重程度显著降低，细胞形态有所恢复，提示凉血消银颗粒剂治疗能够缓解银屑病症状，对银屑病有较好的治疗效果，与临床常用药甲氨蝶呤相当，表明凉血消银颗粒剂有望成为临床上治疗银屑病备选药物。

3.2 凉血消银颗粒剂对银屑病小鼠炎症反应的影响银屑病发生发展进程中，炎症因子发挥重要作用，IL-6一般由巨噬细胞、单核细胞分泌，有助于角质细胞增生，促进银屑病发展，与其严重程度呈正相关［15］。IL-1能够活化B细胞、T淋巴细胞且能够介导体液免疫，银屑病患者血清中IL-1水平明显高于健康人群，提示IL-1水平与银屑病发生发展相关［16］。IL-23是促炎性细胞因子，参与机体自身免疫疾病和控制感染，在银屑病患者血清中高表达，与银屑病发病相关［17］。TNF-α能够参与机体炎症反应，促进角质形成细胞增生，其水平与银屑病患者皮损面积呈正相关［18］。本研究发现，与对照组相比，模型组小鼠血清TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平显著升高，提示银屑病的发生伴随细胞炎症因子过表达；与模型组相比，凉血消银颗粒剂组、甲氨蝶呤组TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表达水平显著降低，凉血消银颗粒剂组与甲氨蝶呤组相比无差异，提示经治疗后细胞炎症因子水平下降，银屑病小鼠体内炎症反应得到缓解，但是凉血消银颗粒剂通过何种通路下调细胞炎症因子表达水平还有待进一步研究。

3.3 凉血消银颗粒剂对银屑病小鼠miR-155/SOCS1信号通路的影响银屑病的发病过程涉及多种信号通路参与，研究发现异丙酚能够抑制miR-155表达水平，上调SOCS1水平来减轻小胶质细胞对脂多糖（LPS）的神经炎症反应，提示异丙酚可能通过miR-155/SOCS1信号通路下调细胞炎症因子水平，缓解炎症反应［19］。此外，还有研究发现miR-155能够促进吸血虫感染早期炎症反应，通过负调控SOCS1水平参与吸血虫感染患者病情的进展［20］。本研究发现，与对照组相比，模型组miR-155表达水平显著升高，SOCS1表达水平显著降低，提示miR-155/SOCS1信号通路可能参与银屑病小鼠炎症反应；进一步分析发现，与模型组相比，凉血消银颗粒剂组、甲氨蝶呤组miR-155表达水平显著降低，SOCS1表达水平显著升高，凉血消银颗粒剂组与甲氨蝶呤组相比无差异，提示凉血消银颗粒剂能够下调miR-155表达水平、上调SOCS1表达水平，可能通过抑制miR-155/SOCS1轴活化而缓解银屑病小鼠病症。

综上所述，凉血消银颗粒剂可能通过抑制miR-155/SOCS1轴活化，降低炎症反应，进而缓解银屑病小鼠病症，推测其有望成为临床上治疗银屑病的备选药。但是，由于本研究样本量较小，且并不能完全代表人类银屑病的发病过程，因此需要扩大样本量并从细胞水平进一步验证。