Nd: YAG 激光对钛种植体表面影响的研究

葛琳华，孙梦君，束 蓉

上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院牙周病科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室/上海市口腔医学研究所，上海 200011

激光是种植体周围病的治疗方式之一，但由于种植体特殊的材质和形态，在应用激光进行治疗时，要考虑其对种植体表面的影响。

掺钕钇铝石榴石（neodymium-doped: yttrium aluminum garnet，Nd: YAG）激光波长为1 064 nm，有很强的杀菌作用，但也有报道[1]表明Nd: YAG 激光对种植体表面形态的影响比较明显。新型Nd: YAG 激光又称为水雾激光，采用水/汽喷雾冷却系统，辅助激光工作的同时，在组织表面形成雾状保护层，避免因为激光的高热量而导致热损伤。本研究拟观察新型Nd: YAG 水雾激光对种植体表面形态和种植体表面成骨细胞附着的影响，从而评估Nd: YAG 水雾激光治疗种植体周围炎的安全性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

将96 个直径10 mm、厚1 mm 的钛片进行表面处理，其纯钛表面的处理模式包括：机械研磨抛光（mechanically polished，MP）48 个、喷砂大颗粒酸蚀（sandblasted, large- grit and acid-etched，SLA）48 个。

1.2 实验分组

将MP 及SLA 钛片分别随机分为3 组：实验组（Nd: YAG 激光处理组）、对照组[掺铒铬钇钪镓石榴石激光处理组（erbium, chromium-doped: yttrium scandium gallium garnet，Er, Cr: YSGG）]和空白对照组，每组16 个MP 处理钛片及16 个SLA 处理钛片。

1.3 激光处理

1.3.1 Nd: YAG 激光 Nd: YAG 口腔水雾激光治疗机（舒镭适，中国），波长为1 064 nm。激光参数：功率1.5 W，水2 气3，光纤直径400 μm，非接触模式，距离1.5 mm。每个钛片表面只扫描1 次。

1.3.2 Er, Cr: YSGG 激光 Er, Cr: YSGG 水激光口腔治疗仪（Biolase，美国），波长2 780 nm。激光参数：功率1.5 W，频率20 Hz，模式S，水10%，气15%，光纤头MZ6，非接触模式，距离1.5 mm。每个钛片表面只扫描1 次。

1.4 钛片表面形态观察

各组取1 个MP 钛片及1 个SLA 钛片进行干燥，粘台后行真空纯金镀膜，在扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）下观察钛片表面形态，分别放大50 倍、300 倍及1 000 倍，拍摄图像。

1.5 细胞培养

将人骨肉瘤细胞MG63 培养于含100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养液中，待细胞达80%～90%融合后，采用0.25%胰酶-0.02% EDTA 消化细胞传代培养。

1.6 细胞黏附数量观察

将钛片置于24 孔板中，并以5×104/mL 密度接种MG63 细胞，每孔1 mL。培养4 h 后，弃去上清，PBS 洗3 次以去除未黏附于钛片的细胞，室温下采用4%多聚甲醛固定已黏附于钛片上的细胞30 min，DAPI 染色5 min，荧光显微镜下观察（×100）。每组MP 钛片及SLA 钛片各3 个，每个钛片随机选取3 个视野进行计数。

1.7 细胞黏附基因表达检测

将钛片置于24 孔板中，并以1×105/mL 密度接种MG63 细胞，每孔1 mL。培养4 h 后，弃去上清，PBS洗3 次以去除未黏附于钛片的细胞。将钛片取出置于新的24 孔板中，Trizol 收集黏附于钛片的细胞，每组收集MP钛片及SLA 钛片各4 个，进行后续RNA 提取、反转录及real-time PCR，重复3 次。引物序列见表1。Real-time PCR 反应条件：95℃ 30 s（1 个循环）；95℃ 5 s，60℃ 30 s（40 个循环）。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

1.8 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0 软件进行统计分析。定量资料以x±s 表示，采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 激光处理对钛片表面形态的影响

与未经激光处理的对照组相比，经Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光处理后的MP 钛片（图1A）与SLA 钛片（图 1B），在SEM 下放大50 倍、300 倍、1 000 倍观察，均未发现钛片表面形态的改变。

2.2 激光处理对钛片表面细胞黏附数量的影响

通过细胞免疫荧光检测发现，与未经激光处理的对照组相比，Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光处理MP 钛片与SLA 钛片后，4 h 内MG63 细胞在2 种钛片表面的黏附数量均未发生明显改变（表2），差异无统计学意义（均P ＞0.05）（图2A、2B）。

2.3 激光处理对钛片表面细胞黏附基因表达的影响

通过real-time PCR 检测发现，与未经激光处理的对照组相比，Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光处理MP 钛片与SLA 钛片后，MG63 在2 种钛片表面的黏附基因FAK、VCL、FN1、COL1A1 及ITGB1 表达均未发生明显改变，差异无统计学意义（均P＞0.05）（表3、图3）。

图1 2 种激光处理对钛片表面形态影响的SEM 观察结果Fig 1 SEM observation of the effect of two laser treatments on the surface morphology of titanium sheets

表2 2 种激光处理后MG63 细胞在钛片表面黏附的数量Tab 2 Number of MG63 cells adhesion on the titanium surface treated by two kinds of laser

图2 激光处理对MG63 细胞在钛片表面黏附数量的影响Fig 2 Effect of laser treatment on the adhesion quantity of MG63 cells on the surface of titanium sheets

表3 2 种激光处理钛片表面细胞黏附基因相对表达Tab 3 Relative expression of cell adhesion genes on the surface of two laser-treated titanium sheet

图3 激光处理对钛片表面细胞黏附基因表达的影响Fig 3 Effects of laser treatment on the expression of cell adhesion genes on the surface of titanium sheets

3 讨论

激光作为口腔领域的一种治疗方法临床应用较广泛，由于其波长的不同，特性不同，其应用范围、治疗效果也各有不同。Nd: YAG 激光是以掺钕钇铝石榴石晶体为活化介质的固体激光器，波长为1 064 nm，水吸收率为0.144，穿透力强，穿透深度可达1 400 μm，能选择性吸收黑色素和血红蛋白，可被含色素的细菌所吸收，通过光热效应作用于组织，杀菌、凝血效果好。在牙周炎治疗方面，Nd: YAG 激光被用于牙周炎的袋内清创，去除感染组织。由于不同波长对组织作用深度的不同，Nd: YAG 激光相对来说在牙周袋内杀菌作用更强，与传统牙周治疗方法结合，可取得更好疗效。

种植体周围炎和种植体黏膜炎是种植体的主要并发症。种植体周围炎在临床上表现为种植体周软组织炎症、探诊出血、探诊深度增大、牙槽骨吸收、种植体松动、种植体周出现透射区, 与牙周炎的临床表现极为相似。有报道在动物实验中观察到无论是天然牙还是种植体周围龈沟中的微生物变化和牙龈的组织学变化都很相似。炎症的产生与种植体周的龈下菌群密切相关。在发生种植体周围炎病损处有牙周可疑致病菌的存在,目前学者们基本认同: 种植体周围炎和牙周炎均是细菌感染引起的炎症性疾病[2]。激光治疗种植体周病的研究很多，但激光作用于种植体要注意对种植体表面的影响。在种植体周围炎的治疗中，Nd: YAG 激光有很强的杀菌作用。但也有报道Nd: YAG 激光对种植体表面形态的影响比较明显[1,3]。纯钛表面能吸收Nd: YAG 激光，会造成种植体表面熔化、形成凹坑、出现裂纹，而种植体表面结构的变化会影响骨整合。有研究结果显示，Nd: YAG 激光参数设置不同，对种植体表面影响不同，输出功率越小，对种植体表面的破坏越小[3]。

激光能量的吸收会产生一系列热变化，例如：蛋白质变性（＞50℃）、蛋白质凝结（＞60℃）、汽化与烧蚀（＞100℃）以及组织碳化（＞200℃）[4]。激光束产生的热量可能会损坏植入物表面。舒镭适水雾激光治疗机的水汽雾化冷却技术可以辅助激光工作的同时，在组织表面形成雾状保护层，避免因为激光的高热量而导致热损伤。舒镭适水雾激光治疗机相比于传统Nd: YAG 激光单一脉冲低重频工作模式，舒镭适加入高重频工作端，使热能不易散发，累积在治疗局域，同时在同步输出的水雾保护作用下，用更低的功率就能低风险地完成更加高效的治疗。舒镭适水雾激光治疗机用于种植体表面消毒的推荐参数是功率1.5 W，水2 气3，光纤直径400 nm，非接触模式，距离1.5 mm。

Er, Cr: YSGG 激光，波长为2 780 nm，属于铒（erbium，Er）激光家族。Kreisler 等[5]对3 类不同涂层（钛浆喷涂、酸蚀、羟基磷灰石）的72 个种植体使用Er: YAG 激光（60 ～120 mJ，脉冲型，最大重复频率10 Hz）灭菌，发现即使只是低能量的照射，种植体表面也出现了明显的灭菌效果。Schwarz 等[6]的一项体内研究发现，Er: YAG激光能有效清除残留的龈下结石，而没有任何热损伤。Er 激光家族在种植体表面的清洁作用是有效和安全的[7]。Azzeh 等[8]在种植体周围炎手术治疗中使用Er, Cr: YSGG激光（功率1.75 W，频率20 Hz，MZ6，非接触模式，距离～5 mm）清创、去肉芽及对种植体表面进行消毒，术中植骨，随访18 个月，种植体周围骨增量效果明显、稳定。 因此，本研究以Er, Cr: YSGG 激光为对照，观察Nd: YAG 水雾激光对种植体表面的安全性。

Giannini 等[9]的研究中Nd: YAG 激光器在具有适当的工作参数（20 mJ，50 或70 Hz）的情况下使用时，能够在不损坏钛表面的情况下对有氧和厌氧菌产生一致的微生物消融。李倩等[10]的研究结果显示Nd: YAG 激光直接照射种植体表面可引起表面结构明显变化和周围组织热损伤风险，采用移动照射操作模式时钛盘表面结构破坏减弱。本研究中Nd: YAG 激光（功率1.5 W，水2 气3，光纤直径400 nm）和Er, Cr: YSGG 激光（功率1.5 W，频率20 Hz，模式S，水10%，气15%，光纤头MZ6）照射采用的参数都是低能量、非接触方式，是临床上适合种植体表面消毒的参数。经过Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光移动照射操作模式处理后钛片SEM 的结果显示均未发现钛片表面形态的改变，无裂纹或熔融。

种植体表面骨形成影响因素包括受植区的生物学特性和种植体的表面特性。种植体的表面特性是指种植体的表面形态、表面元素和表面亲水性等[11]。Faeda 等[12]在使用Nd: YAG 激光处理种植体表面时发现种植体表面粗糙度增加，和骨组织的接触面积增大，有利于骨整合。人成骨肉瘤细胞株MG63 为一标准细胞株，研究取材方便、表达稳定。本研究以MG63 细胞为研究对象，通过观察激光处理后钛片表面细胞的黏附数量，发现与未经激光处理和Er, Cr: YSGG 激光处理的对照组相比，Nd: YAG 激光处理MP 钛片与SLA 钛片后，MG63 细胞在2 种钛片表面的黏附数量均未发生明显改变。

整合素（integrin）是主要的黏附分子之一，用于介导细胞间及细胞和细胞外基质间的相互识别和黏附。因而，本研究进一步检测了2 种激光处理钛片表面的黏附基因FAK、VCL、FN1、COL1A1 及ITGB1 的表达，结果未见差异。这些基因在调节细胞黏附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。因此，种植体用Nd: YAG 激光消毒，对种植体表面成骨细胞的增殖、黏附没有影响，不会影响骨整合，但我们的结果也未显示激光治疗后能促进成骨细胞的附着，可能与激光参数的设置有关，本研究采用的Nd: YAG激光参数是功率1.5 W，水2 气3，光纤直径400 nm，非接触模式，适用于种植体表面消毒，激光能量较低，从本研究结果来看，采用这一能量，对种植体表面没有影响。

新型Nd: YAG 水雾激光没有热损伤，在对种植体表面消毒状态的较低能量应用中未对其表面造成破坏，对种植体表面是安全的，适合于临床应用。但本研究应用的激光设置比较单一，还需对Nd: YAG 水雾激光在种植体治疗中的各项参数做进一步研究来明确其安全性。

参·考·文·献

[1] Romanos GE, Everts H, Nentwig GH. Effects of diode and Nd: YAG laser irradiation on titanium discs: a scanning electron microscope examination[J]. J Periodontol, 2000, 71(5): 810-815.

[2] Buchmann R, Khoury F, Pingel D, et al. The microflora recovered from the outer-surfaces of the Frialit-2 implanto-prosthetic connector[J]. Clin Oral Implant Res, 2003, 14(1): 28-34.

[3] Pick RM, Colvard MD. Current status of lasers in soft tissue dental surgery[J]. J Periodontol, 1993, 64(7): 589-602.

[4] Monteiro L, Delgado ML, Garces F, et al. A histological evaluation of the surgical margins from human oral fibrous-epithelial lesions excised with CO2laser, Diode laser, Er: YAG laser, Nd: YAG laser, electrosurgical scalpel and cold scalpel[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2019, 24(2): e271-e280.

[5] Kreisler M, Kohnen W, Marinello C, et al. Bactericidal effect of the Er: YAG laser on dental implant surfaces: an in vitro study[J]. J Periodontol, 2002, 73(11):1292-1298.

[6] Schwarz F, Rothamel D, Becker J. Influence of an Er: YAG laser on the surface structure of titanium implants[J]. Schweizer Monatsschrift Fur Zahnmedizin,2003, 113(6): 660-671.

[7] Nejem Wakim R, Namour M, Nguyen H, et al. Decontamination of dental implant surfaces by the Er: YAG laser beam: a comparative in vitro study of various protocols[J]. Dent J, 2018, 6(4): 66.

[8] Azzeh MM. Er, Cr: YSGG laser-assisted surgical treatment of peri-implantitis with 1-year reentry and 18-month follow-up[J]. J Periodontol, 2008, 79(10): 2000-2005.

[9] Giannini R, Vassalli M, Chellini F, et al. Neodymium: yttrium aluminum garnet laser irradiation with low pulse energy: a potential tool for the treatment of periimplant disease[J]. Clin Oral Implant Res, 2006, 17(6): 638-643.

[10] 李倩, 孔亚群, Alaxander Franz, 等. Nd: YAG 激光照射对种植体表面结构和温度的影响研究[J]. 中国实用口腔科杂志, 2017, 10(6): 360-364.

[11] Schneider GB, Perinpanayagam H, Clegg M, et al. Implant surface roughness affects osteoblast gene expression[J]. J Dent Res, 2003, 82(5): 372-376.

[12] Faeda RS, Tavares HS, Sartori R, et al. Evaluation of titanium implants with surface modification by laser beam: biomechanical study in rabbit tibias[J]. Braz Oral Res, 2009, 23(2): 137-143.