长链非编码RNA COL11A1-208 在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

蒋英英，秦 星，张建军，陈万涛

1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面-头颈肿瘤科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海 200011；2. 潍坊医学院口腔医学院口腔预防医学教研室，潍坊 261053

头颈癌是全球高发恶性肿瘤之一，严重影响患者生命健康和生活质量[1-2]。口腔癌作为常见的头颈癌，约90%为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC，简称口腔鳞癌），其局部复发率高、转移率高、预后较差。尽管手术、放射治疗（放疗）和化学治疗（化疗）等治疗技术的发展提高了口腔鳞癌的局部控制，但其5 年生存率仍仅有60%左右；对于晚期口腔鳞癌患者，5 年生存率则更低[3]。口腔鳞癌的早期诊断和早期治疗是控制病情、提高生存率的关键环节[4]。因此，寻找新的口腔鳞癌诊断、预后和治疗标志物具有重要的临床价值。

长 链 非 编 码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是长度大于200 个核苷酸但缺乏蛋白质编码潜能的RNA转录产物，参与DNA 复制、RNA 转录、蛋白质翻译、细胞发育和分化等，是细胞生物学的重要调节因子[5-6]。近年来的研究[7]发现，lncRNA 在肿瘤的发生发展中起重要的作用；而在口腔鳞癌中，lncRNA 的异常表达与其发生进展也存在密切关系，可能可以作为口腔鳞癌诊断和预测预后的生物标志物或治疗的靶点[8-9]。

本研究利用基因芯片与生物信息学技术，对6 例口腔鳞癌患者癌组织及对应癌旁正常组织中的差异表达lncRNA 进行筛选，发现Ⅺ型胶原α1（collagen type Ⅺ alpha 1 chain，COL11A1） 的 非 编 码 转 录 本 之 一COL11A1-208（ENST00000470170.1）在口腔鳞癌组织中高表达，提示其可能是调控口腔鳞癌恶性表型的关键分子之一。随后通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测COL11A1-208 在74 例口腔鳞癌患者癌组织内的表达并比较不同临床特征患者间的差异，评价其在口腔鳞癌患者预后预测和诊断中的潜在价值，探讨其在口腔鳞癌发生进展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

所有组织样本及临床信息均来自“上海市口腔颌面部肿瘤组织样本及生物信息数据库共享服务平台”（http://mdl.shsmu.edu.cn/OMNDB/page/data/data.jsp）。该信息库的组织样本收集储存及定期随访均由专门技术人员负责。本研究已通过上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。

自信息库选取2017 年3 月—2018 年3 月在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面-头颈肿瘤科明确诊断为口腔鳞癌的患者，且入选对象均无术前放疗、化疗及其他治疗史，排除全身其他恶性肿瘤史。术中口腔鳞癌及其癌旁组织（距离癌组织边缘2 cm 以上的位置）离体后，迅速切成所需组织小块，放入冻存管内，并保存于液氮中；同时收集患者年龄、性别、烟酒习惯、病理分级、临床分期（TNM 分期），有无淋巴结转移、局部侵袭等临床资料。术后通过查看原始病历、电话访问、门诊复查的方式进行定期随访，患者死亡则终止随访，最短随访时间为3 年（截止随访时间为2020 年8 月），期间电话随访连续3 次失败则归为失访，并记录无进展生存期与总体生存时间。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol 试剂、PrimerScript-RT 试剂盒和qPCR 试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，RNAlater 储存液、mirVana ™ miRNA 分离试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。全自动样品快速研磨机（JXFSTPRP-64）购自上海净信实业发展有限公司，实时荧光定量PCR 仪（ABI StepOne）购自美国Life Technologies 公司，超微量分光光度计（NanoDrop ND-2000）购自美国NanoDrop 公司。本研究所用引物由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。

1.3 lncRNA 基因芯片检测

癌组织及癌旁组织离体后迅速放入RNAlater 储存液中，预冷的无RNase PBS 缓冲液冲洗2 次，置于组织研磨机中匀浆1 min，使用mirVana ™ miRNA 分离试剂盒提取组织总RNA 并进行纯化。lncRNA 基因芯片的检测及初步分析由上海欧易生物医学科技有限公司完成，其流程简述如下。总RNA 使用超微量分光光度计进行定量，运用Agilent Bioanalyzer 2100 （Agilent Technologies）检测RNA 完整性，使用Agilent Human lncRNA 芯片进行检测。将RNA 反转录成cDNA，并用Cyanine-3-CTP（Cy3）进行标记；然后将标记好的产物和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）扫描得到原始图像。最后，运用Feature Extraction 软件（version 10.7.1.1，Agilent Technologies）处理原始图像提取原始数据，再用GeneSpring 软件（version 12.5，Agilent Technologies）进行quantile 标准化和后续处理。

1.4 组织RNA 提取、反转录与qPCR 检测

提取口腔鳞癌组织及癌旁正常组织RNA 前，标本用预冷的无RNase PBS 缓冲液冲洗2 次，置于组织研磨机中匀浆1 min。用TRIzol 试剂提取组织的总RNA；用PrimerScript-RT 试剂盒进行反转录。按照qPCR 试剂盒说明书配置反应体系，反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。每个样本取3 个重复孔CT值平均数。

COL11A1-208 的上、下游引物序列分别为5'-GCTTCTGGCATCACAGTTCACT-3'和5' -GACACCTAATGACTCTTTTCCTCTT-3'，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的上、下游引物序列分别为5' -GAACGGGAAGCTCACTGG-3'和5' -GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。

1.5 qPCR 的观察指标

qPCR 反应以GAPDH 作为内参，获得各样本组织ΔCT值（ΔCT=COL11A1-208 基因CT值－ GAPDH 基因CT值）；计算癌组织或癌旁组织的ΔΔCT值（ΔΔCT=癌或癌旁组织COL11A1-208 基因ΔCT值－同类组织中COL11A1-208 表达水平最低的ΔCT值）。分析癌组织及癌旁组织的COL11A1-208 基因表达水平时采用2－ΔΔCT值，分析不同临床特征患者的癌组织COL11A1-208 基因表达水平时采用ΔCT值（表达水平越高，ΔCT值越小）。

qPCR 中口腔鳞癌组织相对癌旁组织COL11A1-208 基因表达的fold-change（FC）值=癌组织2－ΔΔCT值/对应癌旁组织2－ΔΔCT值，并以2 为底取对数值（log2FC），分析COL11A1-208 基因在口腔鳞癌中的表达水平。FC 值＞2，即认为表达上调[10]。

1.6 统计学分析

应用SPSS 16.0 和GraphPad Prism 7.0 软件进行数据分析和作图。定量资料用x±s 表示，癌组织及癌旁组织间COL11A1-208 的表达差异采用配对t 检验进行比较；不同临床特征的口腔鳞癌患者间COL11A1-208 的表达水平的比较采用非参数检验（2 组比较用Mann-Whitney U 检验，3 组及以上比较用Kruskal-Wallis H 检验）。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价组织COL11A1-208 水平在口腔鳞癌诊断中的潜能；Kaplan-Meier 法分析不同COL11A1-208 水平患者的生存时间。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COL11A1-208 在lncRNA 基因芯片中的表达检测结果

对6 例口腔鳞癌患者癌组织及其癌旁组织的lncRNA表达谱芯片进行差异表达基因分析，结果显示，癌组织中呈低表达（FC 值＜0.5）的lncRNA 有45 个，呈高表达（FC 值＞2）的lncRNA 有30 个（图1A）。在高表达的lncRNA 中，ENST00000470170（COL11A1-208）的FC 值最大（FC 值=12.32，P=0.000）；其长度为785 bp，属于非编码蛋白的基因转录本（图1B）。

图1 6 对口腔鳞癌组织及其癌旁正常组织中差异表达的lncRNAFig 1 LncRNAs differentially expressed in six pairs of OSCC tissues and adjacent normal tissues

2.2 COL11A1-208 在qPCR 中的表达检测结果

对74 例口腔鳞癌患者癌组织及其癌旁组织cDNA 进行qPCR 分析，发现COL11A1-208 在癌组织中显著高表达（P=0.000，图2A），相比对应的癌旁组织，癌组织中COL11A1-208 表达上调（FC 值＞2）的样本为52 例（图2B）。

图2 qPCR 检测COL11A1-208 在口腔鳞癌组织及癌旁正常组织内的表达Fig 2 Expression of COL11A1-208 in OSCC tissues and adjacent normal tissues determined by qPCR

2.3 COL11A1-208 表达水平与临床特征的关系

对74 例口腔鳞癌患者的临床资料进行分析，结果显示：TNM 分期较晚（Ⅲ ～ Ⅳ期）的患者癌组织中COL11A1-208 的表达水平显著高于TNM 分期较早（Ⅰ ～ Ⅱ期）者（P=0.001）；而口腔鳞癌组织中COL11A1-208 的表达水平在其他不同临床特征患者间差异均无统计学意义（表1）。

表1 不同临床特征患者COL11A1-208 表达水平的比较Tab 1 Comparison of COL11A1-208 levels between the patients with different clinical features

Continued Tab

2.4 COL11A1-208 对口腔鳞癌诊断价值的分析

以最终病理诊断结果作为金标准，根据COL11A1-208在74 对口腔鳞癌组织和对应癌旁正常组织中的表达水平，应用ROC 曲线分析其在口腔鳞癌诊断中的参考价值。结果发现，ROC 曲线的曲线下面积（area under the curve，AUC） 为0.702（95%CI 0.617 ～0.788）， 灵 敏度为87.8%，特异度为54.1%（P=0.000）（图3），提示COL11A1-208 对口腔鳞癌的诊断具有一定的参考价 值。

图3 COL11A1-208 的表达水平诊断口腔鳞癌的ROC 曲线图Fig 3 ROC curve of COL11A1-208 expression in the diagnosis of OSCC

2.5 口腔鳞癌组织中COL11A1-208 的表达水平与患者预后的关系

根据癌组织COL11A1-208 相对表达量的中位数将74例口腔鳞癌患者分为COL11A1-208 高表达组（n=37）及低表达组（n=37）。Kaplan-Meier 生存分析和log-rank 检验分析显示，COL11A1-208 高表达组患者3 年总体生存率为51.35%（19/37），而低表达组患者3 年总体生存率为86.49%（32/37）；COL11A1-208 高表达组患者的3 年生存时间显著短于低表达组患者（χ2=9.645，P=0.002）（图4）。

图4 COL11A1-208 不同表达水平的口腔鳞癌患者3 年总体生存率Fig 4 3-Year overall survival rate of OSCC patients with different COL11A1-208 expression

3 讨论

口腔鳞癌是一种受多因素影响的疾病，其发生发展与表观遗传修饰、非编码RNA 等多种因素有关。与绝大多数实体肿瘤一样，早期诊断和治疗是提高口腔鳞癌患者预后的关键因素之一，因此探索更多与口腔鳞癌发生发展相关的分子靶点至关重要[6]。lncRNA 作为近年来备受关注的一类非编码RNA，在肿瘤形成、增殖和转移的过程中起着广泛的作用[11]；研究发现，lncRNA 的表达异常与多种类型肿瘤（如胃癌[12-13]、结肠癌[14]等）的发生发展关系密切，有希望作为肿瘤早期诊断和治疗的分子标志物或基因治疗靶点。已有报道指出，口腔鳞癌组织中异常表达的lncRNA，如miR-31 宿主基因（MIR31 host gene, MIR31HG）[15]、肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1（actin filament-associated protein 1-antisense RNA1, AFAP1-AS1）[16]、肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）[17]、尿路上皮 癌 胚 抗 原1（urothelial carcinoma antigen 1, UCA1）[18]和INK4 基因座中反义非编码RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 locus, ANRIL）[19]等，能够促进口腔鳞癌的转移；另外，在口腔鳞癌组织中表达异常的lncRNA，如AFAP1-AS1[20]、母源性印记基因3（maternally expressed gene 3, MEG3）[21]、HOX 转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）[22]、1 号 染 色 体 上 的FAL1（focally amplified lncRNA on chromosome 1, FAL1）[23]等，均与口腔鳞癌患者的临床特征有关；在口腔鳞癌中表达异常且调控肿瘤细胞恶性生物学功能的lncRNA 有望成为口腔鳞癌预后、诊断的辅助指标[24]。本课题组以往的研究[25]发现，lncRNA LINC00460 在口腔鳞癌组织的高表达与淋巴结转移和病理分级有关，提示LINC00460 可能作为口腔鳞癌精准预后预测和靶向治疗的潜在靶点；lncRNA KTN1-AS1 在口腔鳞癌组织内的表达水平与肿瘤大小、局部侵袭和复发有关，且检测KTN1-AS1 联合miR-153-3p 可提高口腔鳞癌诊断的敏感度和特异度，提示KTN1-AS1 有望成为口腔鳞癌诊断和预后预测的分子标志物[26]。由此可见，lncRNA 作为口腔鳞癌预后预测和靶向治疗靶点的前景十分广阔。

本研究对口腔鳞癌组织lncRNA 表达谱芯片的结果进行分析，发现COL11A1-208 的表达明显高于对应癌旁正常组织。COL11A1-208 位于染色体1p21 区域，是由2 个外显子组成的非编码RNA 转录产物，是COL11A1 基因的转录本之一。近年来研究[27-28]发现，COL11A1 的异常表达与肿瘤（如头颈鳞癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌、胃癌和非小细胞肺癌等）发生发展有关，可作为肿瘤预后预测和诊断治疗的潜在靶点。参考以往基因芯片结果[29-30]发现，与正常组织相比，COL11A1 在头颈鳞癌组织中表达明显升高；同时，COL11A1 在转移的头颈鳞癌组织中表达水平明显高于未转移的头颈鳞癌组织[31]。该结果提示，COL11A1-208 可能对口腔鳞癌的发生发展及预后产生一定的影响。本研究采用qPCR 对74 对口腔鳞癌组织及癌旁正常组织样本进行COL11A1-208 的表达分析，发现COL11A1-208 在口腔鳞癌组织中显著高表达；虽然有22 例癌组织的COL11A1-208 表达相比正常组织无明显高表达或呈低表达，但可能与肿瘤的异质性有关，肿瘤组织的分化程度、患者的个体差别等都会影响肿瘤内基因的表达水平。此外，COL11A1-208 的表达水平与临床分期有关：早期的口腔鳞癌组织内COL11A1-208 的表达水平显著低于晚期癌组织，提示COL11A1-208 作为具有临床特性的lncRNA，具有一定的临床应用潜力。本研究初步评价了COL11A1-208 作为诊断口腔鳞癌患者生物标志物的可行性，采用ROC 曲线分析发现其AUC 为0.702，灵敏度较高（87.8%），提示COL11A1-208 在口腔鳞癌诊断上有一定的价值；但其诊断特异度较低（54.1%）。本研究将癌旁组织内的基因表达水平作为正常组织纳入ROC 评价体系，由此得到的结论仅有一定的参考价值，还需要进一步的验证。对患者进行随访研究发现，COL11A1-208高表达组患者的3 年生存率低于低表达组，该结果提示COL11A1-208 可能与口腔鳞癌患者的不良预后密切相关。关于COL11A1-208 作为早期诊断和预后预测生物标志物的潜能，尚需进一步扩大样本量、延长随访时间并通过分子生物学实验深入研究。再者，鉴于COL11A1-208 与COL11A1 在口腔鳞癌组织表达和临床特征上的重要意义，两者之间的因果及调控关系需要在今后继续研究。

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