新鲜瓜蒌不同部位总黄酮的含量测定

赵启华 杜成兴 潘年琼 霍昕 杨迺嘉

摘 要：通过测定新鲜瓜蒌不同部位总黄酮的含量，测得其中总黄酮含量最高的部位，为瓜蒌的综合开发利用提供参考依据。新鲜瓜蒌分离成不同部位后，经过正交试验方法筛选，得到最佳提取方法。运用最佳提取方法，以芦丁为对照品，10%ALCl3为显色剂，在279nm处，采用紫外分光光度法测定新鲜瓜蒌不同部位的总黄酮含量。结果显示，最佳提取方法为：60%乙醇回流提取2次，每次2h。芦丁在0.002012mg/mL～0.064384mg/mL之间呈良好的线性关系（Y=9.2611X+0.2822，R=0.9991），回收率在95%～105%之间，RSD小于2.0%。新鲜瓜蒌不同部位总黄酮含量从高到低为：新鲜瓜蒌汁﹥新鲜瓜蒌皮﹥新鲜瓜蒌子﹥新鲜瓜蒌瓤，新鲜瓜蒌汁中总黄酮含量最高。

关键词：瓜蒌;总黄酮;含量测定;紫外分光光度法

中图分类号：R24 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2020）12-0118-04

瓜蒌属于多年生攀缘型草本植物，来源于葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）或双边栝楼（Trich-osanthes rosthornii Harms）的干燥且成熟的带果梗全果[1]。从瓜蒌的来源来看，栝楼属为葫芦科中一个比较大的属，全球共有80来种[2]。瓜蒌主要分布地区有安徽、山东、河南和河北等，已引种到全国各地，主要集中在贵州和福建、四川等地。现代研究表明，瓜蒌的化学成分包括油脂及有机酸脂类成分、氨基酸及核苷酸类成分、三萜类成分、甾醇类及其衍生物、生物碱和含氮衍生物、多糖类成分、醛类成分、醇类成分、黄酮及其苷类衍生物、苯丙素类、蛋白质及多肽类成分，还有少量的其他成分比如微量元素等[3-13]。瓜蒌及其制剂常用于治疗心血管疾病，临床上还能够治疗吐痰黄稠和消渴等病症，可提高人体的免疫力，也有抗菌抗氧化、抗肿瘤作用[14-19]。天然黄酮类化合物具有调节骨代谢、预防骨质疏松、抗氧化和抗炎等多种作用[20-25]。另外，它可扩张冠状动脉，提高抗缺氧能力，还能抑制血小板聚集。本实验以芦丁为对照品，10%ALCL3为显色剂，在279nm波长处测定新鲜瓜蒌不同部位总黄酮的含量，拟定总黄酮含量顺序，为瓜蒌种质资源的进一步开发和综合利用提供科学数据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），LIBRORAEL-160型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），TG332A型十万分之一分析天平（日本岛津）。其他试验仪器均由贵州省科晖制药厂企业技术中心提供。

1.2 材料

芦丁对照品（批号：100080-200306，中国药品生物制品检定所），瓜蒌药材采购于贵州省息烽县并经贵州大学关萍教授鉴定为葫芦科植物双边栝楼（Trichosanthes rosthornii Harms）的新鲜成熟果实。水为蒸馏水，其余试剂均为国产分析纯。

2 方法和结果

2.1 新鲜瓜蒌的分离

选取新鲜瓜蒌6个，分离筛选后得到瓜蒌的不同部位，包括瓜蒌皮、瓜蒌瓤、瓜蒌汁和瓜蒌子，分别称重，记录数据，见表1。

2.2 单因素筛选

2.2.1 提取方法的选择

选取新鲜瓜蒌皮为参照，精密称取新鲜瓜蒌皮3份，每份1.0g，分别加入100mL 70%乙醇溶液，分别用超声提取、回流提取和索式提取的方法提取1h，过滤，精密量取2mL滤液加入到25mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，使用紫外分光光度计法在279nm波长处测定吸光度，考察提取方法对总黄酮收率的影响，结果见表2。

结果表明三种提取方法下的总黄酮收率有差異，其中回流提取的总黄酮收率最高，应进行方法选择。

2.2.2 乙醇浓度的选择

精密称取新鲜瓜蒌皮3份，每份1.0g，分别加入50%、60%、70%的乙醇溶液100mL，加热回流提取1h，精密量取2mL样品溶液加入到25mL容量瓶中，分别加对应的乙醇溶液定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，使用紫外分光光度计法在279nm波长处测定吸光度，考察乙醇浓度对总黄酮收率的影响，结果见表3。

结果表明用不同醇度的乙醇提取瓜蒌皮时总黄酮收率有差异，其中60%乙醇提取的总黄酮收率最高，应进行乙醇浓度的选择。

2.2.3 提取时间的选择

精密称取新鲜瓜蒌皮3份，每份1.0g，加入60%乙醇100mL，分别回流1h，1.5h，2h，2.5h，3h，精密量取2mL样品溶液于25mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，使用紫外分光光度计法在279nm波长处测定吸光度，考察提取时间对总黄酮收率的影响，结果见表4。

结果表明当提取时间为2h后，瓜蒌皮总黄酮收率不再有明显提高，反而略有降低，应进行提取时间的选择。

2.3 正交试验设计

根据预实验结果，确定工艺的考察因素为乙醇浓度（因素A）、提取方法（因素B）和提取时间（因素C）以及提取次数（因素D），以新鲜瓜蒌皮总黄酮收率为考虑指标，采用L9（34）正交试验设计表，具体因素水平见表5。

新鲜瓜蒌皮总黄酮提取工艺正交试验结果见表6，方差分析结果见表7。由结果可知，各因素对提取效果的影响程度依次为A>B>C>D，A因素（提取方法）、B因素（乙醇浓度）和C因素（提取时间）均具有统计学意义。在本实验考察范围内，新鲜瓜蒌皮总黄酮提取工艺的最优组合为A2B2C2D2，故新鲜瓜蒌皮总黄酮的最佳提取方法为：用60%乙醇回流提取2次，每次2h。

2.4 方法学考察

2.4.1 对照品溶液的制備

称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品10.06mg置于100mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，超声5min，摇匀。精密量取上述溶液2mL置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液（芦丁浓度为0.008048mg/mL）。

2.4.2 供试品的制备

精密称取新鲜瓜蒌皮1.0g，加入60%乙醇100mL回流提取2次，每次2h，精密量取滤液2mL置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.4.3 测定波长的确定

取对照品溶液和样品溶液5mL，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min。在200nm～600nm波长范围内进行紫外扫描，结果在279nm处均出现最大吸收峰，故选择测定波长为279nm。

2.4.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取芦丁对照品溶液（0.008048mg/mL）0.5mL，1mL，1.5mL，2mL，2.5mL和3mL置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min。以60%乙醇溶液为空白，在波长279nm处测定吸光度，以吸光度A为横坐标，芦丁浓度C为纵坐标，绘制标准曲线，得曲线回归方程：Y=9.2611X+0.2822，R=0.9991，芦丁在0.002012mg/mL～0.064384mg/mL之间呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验

精密量取同一份对照品溶液5mL，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，在279nm波长处测定吸光度，连续测定6次，计算RSD，结果见表8。

试验结果表明RSD为0.75%，说明紫外分光光度计的精密度较好。

2.4.6 稳定性试验

精密量取供试品溶液5mL，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，在279nm波长处每隔1h测定一次吸光度，计算RSD值，结果见表9。

结果表明在1h内，其Abs值较为稳定，RSD为0.73 %，说明供试品在6h内有较好的稳定性。

2.4.7 重复性试验

精密称取新鲜瓜蒌皮1g，共记6份，按2.4.2项下方法处理后，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，在279nm波长处测定吸光度值，计算RSD，结果见表10。

结果显示RSD为1.96%，说明该方法有较好的重复性。

2.4.8 加样回收率试验

精密称取新鲜瓜蒌皮0.5g，共9份，分别加入一定体积的芦丁对照品溶液，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，于279nm波长处测定吸光度，计算总黄酮收率，结果见表11。

结果表明加样回收率在95%～105%，RSD%小于2.0%，说明使用三氯化铝显色法测定瓜蒌总黄酮的检测方法是可行的。

2.5 新鲜瓜蒌各部位溶液的制备

分别精密称取新鲜瓜蒌各部位1g，加入60%乙醇100mL回流提取2次，每次2h，过滤，取滤液2mL于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，摇匀后静置15min，于279nm波长处测定吸光度，计算总黄酮收率，结果见表12。

结果表明：新鲜瓜蒌各部分所含总黄酮含量从大到小依次为：新鲜瓜蒌汁﹥新鲜瓜蒌皮﹥新鲜瓜蒌瓤﹥新鲜瓜蒌籽。

3 结论与讨论

本实验采用三氯化铝显色法对新鲜瓜蒌不同部位的总黄酮进行含量测定，结果表明：新鲜瓜蒌的各部分中，新鲜瓜蒌籽中总黄酮含量最低，新鲜瓜蒌汁中总黄酮含量最高;新鲜瓜蒌各部分所含总黄酮含量从大到小依次为：新鲜瓜蒌汁﹥新鲜瓜蒌皮﹥新鲜瓜蒌瓤﹥新鲜瓜蒌籽。

在新鲜瓜蒌的分离过程中，对瓜蒌瓤和瓜蒌汁的分离，未能完全去除瓜蒌瓤中残留的瓜蒌汁，只能初步过滤分离，对实验数据会有一定影响，但影响不大。目前对瓜蒌总黄酮的鉴别实验中，除了芦丁作为对照，也有槲皮素作为对照的，没有指定成分，需要实验者自行选择。笔者希望通过对新鲜瓜蒌不同部位总黄酮含量比较研究，为以后新鲜瓜蒌的开发利用提供科学数据。

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