外泌体提取及其在糖尿病肾病诊治中的研究进展

（湖南省衡阳市南华大学附属第一医院，湖南衡阳 421000）

0.引言

糖尿病是威胁着人类生命健康的主要疾病之一[1]。糖尿病患者在终末期会出现严重的肾衰竭，其主要原因来自糖尿病肾病，糖尿病肾病早期诊断，能够影响患者的治疗以及预后[2-3]。外泌体最初在研究网织红细胞向成熟红细胞转化的过程中被发现，其来源于晚期内吞体囊泡，在尿液、唾液、腹水以及羊水等体液中，通过投射电子显微镜均可检测到，其直径约为30nm～100nm，形状为双圆盘状或者杯口状，粒径范围在不同的部位中呈现不同的数值，这些囊泡在最初被认为是细胞产生的垃圾，后来研究发现外泌体包含各种信号分子，能够加入机体免疫，细胞迁移等过程[4-5]。细胞之间主要通过外泌体进行交流，研究表明，正常细胞和病变细胞分泌出来的外泌体呈现出不同的负载信号分子，能够影响疾病诊断以及治疗[6]。本文以糖尿病肾病患者为例，探讨外泌体提取及其在糖尿病肾病诊治中的研究进展。

1.外泌体的提取方法

为了能够充分的研究外泌体的功能，需将其从尿液、血液以及细胞上清液当中提取出来，当前外泌体分离的技术有很多，并衍生出多种提取试剂盒，但能够对外泌体的纯度、含量以及生物活性进行同时监测尚无具体方法[7-8]。

随着医疗水平的进步，人们在外泌体提取的过程中，逐渐总结了多种方法，主要包括：超速离心法、超滤离心法、凝胶排阻色谱法、聚合物沉淀法、免疫磁珠法以及微流体系法[9]。

外泌体提取的常规方式为超速离心法，是检验的金标准。该方法操作较简单，能够得到较多的外泌体量，但其耗时长，提取的纯度低，极有可能改变外泌体的大小结构[10]。超滤离心法在操作上较为简单，且用时较短，在过滤的过程中，极易造成外泌体的变形甚至囊泡碎碎，对实验结果造成严重影响[11]。凝胶排阻色谱法是简单有效的外泌体提取方法，能够完整的保存外泌体的生物活性以及完整度，但该操作对设备要求较严格，所需的时间较长，故不能广泛应用[12]。目前，微流体系统用来提取外泌体的方法越来越受到人们的青睐，该方式能够提取到高纯度的外泌体，并且，能够及时地应用于疾病检测。一些科学家联合生产的柱形微流控芯片具有极高的灵敏度，能够分开20nm～110nm的颗粒[13]。2017年，有研究人员提出了新的微流体装置，即在人体血液中捕获和释放外泌体，相对于常规试剂盒，改方法具有更优质的性能。外泌体提取在中国也取得了长足稳定的进步，刘笔锋教授（华中科技大学）研制出了一种微流体芯片，利用特别拓扑纳米材料和识别分子提高了外泌体的提取效率[14]。近期提出了更为高效的提取方式，即通过连续以及无标记的方法，从细胞培养基中进行外泌体提取，达到了外泌体提取量和回收率共同提高的目标[15]。除此之外，来自美国的研究人员通过脂质分子探针对胞外囊泡进行分离，整个过程在15min全部完成，极大地提高了分离速度，且与超高速离心法效率比较，其囊泡成分接近甚至更具优越性[16]。同时该方法与RNA表达以及DNA突变分析等后续分子检测技术相连接。

2.在糖尿病肾病（DN）的生物标志物

检测DN的主要方式是通过尿液检测，其主要标志是尿液总蛋白、miRNA。外泌体具有双层膜结构的特点，能够隔离RNA酶与其他内容物，能够对母细胞进行保护，使其降解作用降低，能够将母细胞生理状态和病理状态充分展示出来，并清晰反应其功能，在准确诊断DN方面，尿外泌体miRNA检测相较于上述标志具有更大优势[17]。

2.1 来源蛋白

Gudehithlu的研究表明，相较于全尿分析，外泌体蛋白标志物在DN患者的肾潜在的蛋白变化中，体现的更加准确，能够以此检测DN患者的疾病发展情况。研究人员曾对130例II型糖尿病患者展开研究，其尿外泌体亮氨酸氨基肽酶以及二肽基肽酶4同DN的发展程度存在正比关系[18]。有研究指出，通过检测I型DN患者不同病程的尿液发现，其中多种蛋白酶和蛋白酶抑制剂表达水平出现了明显的改变。Lou等做出相关研究指出，DN病情的发展影响着尿微泡结合素，能够作为ND检测和检测其发展情况。

2.2 miRNA

外泌体来源miRNA是参与各种生理过程的重要信号分子，在Barutta的研究中指出，糖尿病患者以及微白蛋白尿患者的外泌体miRNA-145以及miRNA-130a水平高于白蛋白尿正常患者。其他相关研究表明，miRNA-192在微量蛋白尿组表达水平显著增长，但在大量白蛋白尿组呈降低模式，辨明其直接影响着DN的检测，成为DN早期患者的重要生物标志[19]。

3.外泌体作为药物载体的研究进展

外泌体能够作为载体对基因、抗原以及蛋白等种类的药物进行研究，为肿瘤和感染类疾病的研究做出了重要的贡献。药物承载外泌体的主要方式是将母细胞与载体实行共混培养，或者将母细胞实行化学转染，使母细胞的外泌体含有足够药量，但其转染无法达到较高的效率，同时不能得到较高的基因表达，具有相对明显的劣势。除此之外，电穿法、皂化法以及超声法等。

迄今为止，对外泌体应用在DN疾病的治疗方面的研究较少，但其在其他方面的研究已经初见成效，在对DN的治疗起到了指导作用[20]。来自墨尔本大学的研究表明，外源蛋白能够通过晚期结构域来加载至外泌体中，然后向小鼠脑内输入外源蛋白（具有生物活性），结果表明，在部分脑区域中出现了异常情况，一些被装入蛋白的外泌体转运到受体神经元。微流体芯片的设计从根本上增加了外泌体的分离效率[21]。

外泌体已逐渐应用于治疗糖尿病的部分疾病。报道指出，外泌体能够阻止糖尿病肾并发症的发生。外泌体已经逐渐成为医学界研究的重要内容，肾细胞外泌体严重影响着人类的生命健康，尿外泌体作为肾细胞外泌体的重要部分，成为了多种疾病的生物标志物[22]。不仅能够快速诊断疾病，而且在肿瘤发展的检测中，起到了重要的作用，除此之外，其还主要作用于评估疾病的治疗效果，预防术后的并发症，为人类的健康做出极大贡献。随着科技水平的不断进步，外泌体将会以新的姿态为DN患者的治疗和预后做出更多的贡献。

4.结语

提取外泌体的方式很多，但目前尚未发现一种方式能够在保证含量的同时，达到纯度高和保证生物活性的优势。目前，外泌体生物学标志物在DN中的研究尚未得到广泛发展，但在DN诊断与病情监测方面突显出了极大优势。虽然有关于在DN药物中应用外泌体作为载体的研究较少，但在相关疾病的治疗过程中，作为药物传递系统，具有巨大的研究前景。