香菇多糖中单糖组成分析技术的研究进展

邱雯曦，周礼仕，钟辉云，王爱萍

(1.四川卫生康复职业学院药学系，四川 自贡 643000；2.四川卫生康复职业学院基础医学部，四川 自贡 643000)

香菇多糖是从香菇中提取出的一种重要生物活性成分，有多种药理活性，如：抗病毒[1]、抗肿瘤[2-3]、抗氧化[4]、抗辐射[5]、降血糖[6]等，其药用价值甚高。香菇多糖是由不同单糖通过糖苷键连接而成的杂多糖，属于高分子多聚物。1969年，香菇多糖第一次被发现并提取[7]，后被证明有抗肿瘤作用[8]，而引起了广泛研究工作者的关注。研究药物的构效关系具有重要意义，香菇多糖的结构与生物活性有着密切关系。对于香菇多糖结构的研究，单糖组成是最基本的研究对象。随着人们对香菇多糖类药品、食品和保健品的开发，质量控制的系统化研究迫在眉睫。多糖的单糖组成指纹图谱可为香菇多糖类药品保健品的质量控制提供重要参考。因此，单糖组成的分析研究尤为重要。

香菇多糖的单糖组成分析包括几个步骤：将多糖水解为单糖、对单糖进行化学衍生、分离单糖组分、对分离后的单糖进行检测分析。本文将从以上几个方面，对香菇多糖单糖组成分析取得的进展及遇到的问题进行综述。

1 降解香菇多糖为单糖方法的选取

降解多糖的方法较多，主要有超声波降解法、电磁辐射降解法、高碘酸氧化、酶水解、酸碱水解法等。

1.1 超声波法

超声降解多糖分子属于一种物理降解法。主要以自由基理论及机械剪切作用来解释超声波降解多糖分子的机理[9]。虽然此降解法操作性强具有绿色环保对外界污染小等优点，但难以将多糖分子彻底分解为单糖且影响因素较多[9-10]。因此，超声波降解法不适合用于多糖水解产物单糖组成的分析。

1.2 酶解法

糖苷酶是目前降解多糖最常用的一类酶，通过降低多糖降解反应活化能，从而加速反应的进行。糖苷酶分为外切糖苷酶和内切糖苷酶两类。酶法降解多糖条件温和，反应时间短且反应效率高。β1,3-葡聚糖酶成功用于裂褶多糖的降解，凝胶渗透色谱法有效的监控了裂褶多糖降解反应程度[11]。酶催化降解多糖反应现在还存在许多不足：酶只能专一性的催化某一类底物；其次多数糖苷酶来源于生物体，难以实现大规模生产；酶需要固定载体上进行催化，若不将酶固定，则催化反应后需将其去除。但随着研究的深入，酶解法有希望成为降解多糖的常用方法。

1.3 酸碱水解法

酸水解属于化学方法，是分析多糖单糖组成目前最常用的降解多糖的方法。酸性溶液中有大量氢离子(H+)，利于将糖苷键中氧原子(O)进行质子化，从而打开糖苷键，苷元脱离，碳正离子溶剂化，最终质子脱去后产生单糖[12]。酸水解多糖比碱水解速率快，且单糖产物结构不易变化。早期的酸水解剂多使用盐酸和硫酸混合酸，不仅操作麻烦且检测结果不准确[13]。近年来，多数文献报道以三氟乙酸(TFA)为酸水解剂[14]，但在水解氨基糖时不宜使用三氟乙酸。香菇多糖酸水解剂多使用三氟乙酸。

2 衍生试剂的选取

单糖分子结构缺乏发色官能团，不能被现在多数检测器识别。而通用检测器的灵敏度不够理想，为了提高检测灵敏度，可将单糖分子进行化学衍后进行检测。衍生剂在不断发展，胺和类胺化合物是较早用于单糖衍生化试剂。随着研究的加深，出现了更多的衍生化试剂：α-萘胺、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolo, PMP)、1-(4-异丙基)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-(4-isopropyl)phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PPMP)、2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC)、苯并吖啶酮-5-乙酰肼(benzoacridinone-5-acetyl hydrazine, BAAH)、3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)等。PMP是最常用的单糖衍生化试剂，与糖的反应能在较温和条件下进行且产物有较强紫外吸收，检测限能达到皮摩尔级[15]。PMP不能衍生修饰果糖、甘露醇和山梨醇，香菇多糖降解产物因不含果糖、甘露醇及山梨醇可以选择PMP[16]作衍生试剂。此外，α-萘胺[17]、AEC[18]也可用于香菇多糖降解单糖的衍生修饰。

3 单糖的分离检测

香菇多糖是由葡聚糖和多种单糖通过糖苷键连接而成的杂环糖。分析检测香菇多糖的方法很多，主要有气相色谱法(GC)、毛细管区带电泳法(CZE)、高效液相色谱法(HPLC)等。

3.1 毛细管电泳技术

毛细管电泳具有分离快速、灵敏度高及样品用量少等优点，主要用于单糖和寡糖的分析检测[19-21]。汲晨锋等采用α-萘胺为衍生试剂，应用毛细管电泳对香菇多糖单糖组分及含量进行分析[17]，香菇多糖单糖组分毛细管区带电泳谱图见图1。实验结果与文献报道基本符合。

Rha：鼠李糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Ara：阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glu：葡萄糖

3.2 气相色谱技术

气相色谱法灵敏度高、重现性好，已用于多种多糖单糖组分的分析检测[22-23]。气相色谱法适于挥发性物质的分析检测，而单糖沸点高不具备挥发性需衍生化生成易挥发物质，衍生过程不仅繁琐，且衍生样品要求较高。李健等将香菇多糖水解单糖与六甲基二硅氨烷衍生，用气相色谱法分析单糖组成及含量[24]。文中还采用了气相色谱质谱联用分析法比较分析香菇多糖单糖组成及含量。赵行等将糖腈乙酰化衍生-气相色谱法用于香菇多糖单糖组成的分析。由于气相色谱法对样品的衍生要求高，单糖色谱峰存有干扰，某些单糖组分需进一步确认[25]。

3.3 高效液相色谱技术

高效液相色谱法不仅不需样品气化，且方法高效，操作简便，稳定性好，技术较成熟，因此广泛用于单糖的分析检测。高效液相色谱法的检测器种类较多，通用型检测器有蒸发光散射检测器和示差检测器，可以直接检测单糖分子。蒸发光散射检测器分析糖类物质不可缺少的检测器[26]。通用型检测最大的缺点是不仅对糖类物质有响应，氨基酸、脂类、碳水化合物等等物质均有响应。香菇除了含有多糖还富含蛋白质、脂肪酸等，若采用高效液相直接检测法势必会有较大误差。紫外可见吸收检测器是高效液相运用较广泛的检测器。单糖无紫外吸收，则需衍生(柱前衍生或者柱后衍生)后方能被紫外检测器识别。单糖常用的衍生的试剂在2中已讨论。柱前衍生高效液相色谱法是分析糖类物质常用的方法[27-29]。

陈志辉等[30]将提纯香菇多糖，经三氟乙酸(TFA)水解后与PMP发生衍生反应，再用高效液相-二极管阵列法进行分析，共标示出13个特征峰，鉴别了6个色谱峰：甘露醇、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、半乳糖、木糖和L-岩藻糖。10批香菇多糖样品HPLC指纹图片重叠图如图2，相似度>0.99，表明香菇多糖PMP柱前衍生HPLC指纹图谱具有较好的稳定性和可控性，可作为香菇质量控制和评价指标的参考依据。高效液相指纹图谱技术已成为中药鉴别及质量控制的重要手段。冯贤达[31]用四种不同的提取法提取香菇多糖，并对四种工艺提取的香菇多糖进行HPLC指纹图谱对比分析，研究其单糖组成的变化。单糖成分的区别会影响香菇多糖的生物活性，通过HPLC指纹图谱的分析可指导企业对提取工艺的选取。

图2 10批香菇多糖样品HPLC指纹图谱重叠图[30]

超高效液相色谱法不仅可以缩短分析时间而且能提高色谱分离度，减少溶剂的消耗，在中药化学成分识别、指纹图谱等领域发展应用，促进中药的质量控制[32]。赵行等[16]利用超高效液相色谱对香菇多糖片中单糖组分进行分析，完全酸水解法将香菇多糖降解为单糖，PMP柱前衍生，二极管阵列检测器检测香菇多糖的酸水解产物。主要单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖，含有少量的岩藻糖和阿拉伯糖。结果表明PMP柱前衍生-超高效液相色谱法是检测香菇多糖片中单糖组分分准确、可靠、快速的方法。

HPLC法和柱前衍生化技术结合在测定多糖单糖组成方面不断发展应用，糖类衍生化试剂也在不断创新。张萍等[33]以3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生剂(ACE)，考察了AEC对不同类型单糖的衍生效果，发现AEC对中性糖的衍生效果大于酸性糖。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖六种中性单糖-AEC衍生物高效液相色谱分离图如图3。香菇多糖水解后生成单糖-AEC衍生物，再由高效液相-二极管阵列法分析检测。作者据此建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析香菇多糖单糖组成，测定结果准确可靠，为香菇多糖的研究及产品评价提高了新的参考方法。

a: Gal; b: Man; c: Glc; d: Ara; e: Xyl; f:Rha

4 结论

香菇多糖单糖组成的分析对香菇多糖药物、香菇多糖保健品、香菇药材原料的鉴定起着重要作用。文中论述了香菇多糖单糖组成分析过程，水解、衍生、分离、检测主要环节的技术的新进展。香菇多糖降解主要采用的是酸水解技术，但随着生物技术及人工酶、纳米酶的发展，酶解法可能发展成降解多糖的常用手段，在温和的条件下实现多糖的降解。对比天然酶，人工酶及纳米酶具有价格便宜、稳定性好、循环利用率高等优势。未来有望发展水解多糖的人工酶或纳米酶。随着色谱技术的快速发展，有可能设计响应单糖的专属检测器，以省去衍生环节，不仅简化单糖的分析检测过程，而且避免衍生过程影响分离分析结果。