一种来源嗜热古菌的耐热β-葡萄糖苷酶制备鸢尾苷元的工艺研究

王 仲，方 伟，董 青，李丽娜

(1.武汉华夏理工学院，湖北 武汉 430223；2.湖北省生物农药工程研究中心，湖北 武汉 430064)

1 绪论

野葛花[1]是我国传统药物，为豆科植物野葛的花。主要有效成分为异黄酮类化合物，是野葛花生长过程中形成的一类次生代谢产物，具有解酒保肝、抗肿瘤、抗炎、抗氧化[2][3]等生物活性。异黄酮大部分以糖苷形式存在，常见如葛花苷、鸢尾苷、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、尼泊尔鸢尾素-7-O-β-D-葡萄糖苷[2]等。其中鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷是葛花异黄酮的主要成分，但是鸢尾黄素是主要药效活性物质。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，简称BGL)[4]又称β-D-葡萄糖苷水解酶，它属于纤维素酶类，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。目前从嗜热古菌中分离出一些BGL，由于其高度耐热稳定性及高活性，显示出工业化优势，因此日益受到人们的重视。

2 仪器与试药

仪器 PHS-25 pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、BS124电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司FNA/JAN系列)、TG16-WS医用离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)、Waters2695高效液相色谱仪

试药β-葡萄糖苷酶(自制)、鸢尾黄素、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷对照品(自制)、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钠、(以上试药均为分析纯)、乙腈(色谱级)、超纯水&蒸馏水(实验室自制)

3 法与结果

3.1 HPCL法检测鸢尾苷元[6]

色谱条件：色谱柱：Waters sunfire C18(2.1 × 150 mm，3.5 um)；柱温40 ℃；检测波长260 nm；进样量6 ul；流速0.3 ml/min。流动相：乙腈梯度洗脱。

3.2 底物溶液和酶溶液的配置

精密称取鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷用pH值6.0的缓冲液定容，配置得到浓度为1 mg/mL的底物溶液，备用。

精密称量BGL，用pH值6.0的缓冲液定容，配置得到浓度为1 mg/mL酶溶液，离心，取上清液，0.45μm微孔滤膜过滤。酶溶液须现配现用。

3.3 鸢尾苷元的制备方法

取0.1mg鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷及0.5 mgBGL，加入pH6.0的缓冲液定容，在实验条件下反应一定时间，反应过程中每间隔20 min剧烈震摇10次，反应完成后精密量取酶解液0.3ml，并加入甲醇定容至1 ml使酶失活，按3.1项中方法进行HPLC检测鸢尾苷元含量。

3.4 单因素试验

将反应液pH值、反应温度、酶与底物的质量比、反应时间分别固定在6.0、90 ℃、5∶1、4h，以鸢尾苷元转化率为衡量指标，只改变其中一个条件进行试验，每个试验平行做3分，考察制备过程中各因素水平的影响。

3.4.1 酶与底物质量比

酶与底物质量比分别设为1∶1、2∶1、5∶1、8∶1、10∶1、20∶1进行反应，结果表明随着酶用量增大，转化率增大，但越往后增大的幅度逐渐变小。所以当底物和酶质量比1∶5时转化率最佳。

3.4.2 反应温度

反应温度分别为80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃进行反应，结果表明鸢尾苷元的转化率先随着温度的升高而升高，在90 ℃时达到最大值，后开始下降。

3.4.3 pH值

分别用缓冲液pH值为4.5、5.0、5.5、6.0进行反应，测定鸢尾苷元峰面积，计算出转化率并作图。结果表明酶解反应受pH值的影响不大，当pH值为6.0时，转化率略高于其他pH值，故确定后续响应面实验时缓冲液pH值保持为6.0。

3.4.4 反应时间

反应时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h进行反应，结果表明1.5 h内随着时间的延长鸢尾苷元的转化率逐渐上升，1.5h后转化率保持平缓。说明鸢尾苷元在1.5 h内已经反应完全。

3.5 Box-Behnken响应面优化实验设计[5]及结果

以反应温度(A)、反应时间(B)、底物与酶质量比(C)三个因素为自变量，每个因素取三个水平，分别以+1、0、-1编码，以鸢尾苷元的转化率为响应值R，进行三因素三水平响应面法Box-Behnken设计试验(见表1)，进行15组试验(试验安排及检测结果见表2)。

表1 响应面因素水平与编码

表2 响应面实验设计及转化率

采用Design-Expert.V8.0软件对表结果进行响应面回归分析，得拟合方程：R=63.33-1.50A-1.25B+5.00C-0.75 AB-0.25AC+2.25BC+0.21A2-12.29B2-23.29C2。

方差分析及回归系数显著性检验结果见表3。该模型P<0.0001，表明二次方程拟合极显著。失拟项P=0.5352>0.05(不显著)，失拟项对纯误差没有显著相关性，说明未知因素对试验结果干扰小。模型相关系数R2=0.9957和调整系数Adj R2=0.9879，均表明该模型拟合程度好。测量的信噪比为35.34(>4为合理)，说明该模型可靠。以上统计学数据均说明方程与实际拟合良好，该模型可用于优化酶解鸢尾苷元的工艺条件。

表3 回归方程方差分析表

从三个因素的显著性检验结果可知，各因素影响大小的排列顺序为：底物与酶质量比(C)>反应温度(A)>反应时间(B)。由回归方程可得出各因子交互作用的响应面3D图和等高线分析图(见图1)。图中可以分析出多个自变量变化对相应值的影响以及响应值对不同自变量变化的敏感程度。由此同样得到各因素影响的排列大小：C>A>B，同样与上述方差分析结果吻合。

图1 各因素两两交互作用对鸢尾苷元转化率影响的响应图(A温度，B时间，C底物与酶质量比)

对实验模型进一步解析，得到理论最佳酶解条件为：(1，-0.07，0.1)即反应温度85 ℃，反应0.965 h，底物与酶质量比1∶5.5，并且在pH为6.0时鸢尾苷元转化率最高。结合实际操作，将上述理论最优工艺条件调整为反应温度85 ℃，反应1h，底物与酶质量比1∶5.5，并且在pH为6.0的情况下重复3此实验验证酶解效果。结果测得平均转化率为62.09 %，RSD=2.23%。该结果与相应预测值62.35%接近，证明该工艺稳定，重现性较好。

4 讨论

酶解反应完成后，我们采取的是冻存的方式，但经检测后发现，在-20 ℃的环境中该酶依旧有一定的活性，这样就无法考察反应时间对鸢尾苷元转化率的影响。因此，酶解反应结束后，立即精密量取一定量的反应液，再加入甲醇定容，甲醇加入后会使酶完全失去活性，然后再进行色谱检测。

5 结论

本实验采用响应面分析法中的Box-Behnken试验设计法，优化了β-葡萄糖水解酶转化制备鸢尾苷元的工艺。本课题选择的这种β-葡萄糖水解酶是来源于嗜热古菌，该酶的反应温度较之普通的葡萄糖水解酶高出许多，因此转化效率高，具有现实意义。通过实验也验证了该酶的转化速率快，一般在一个小时左右就能转化全完，且操作简单方便，适合工业推广。