草氨酸钠对胆管癌细胞自噬与凋亡的影响

何大伟，何敖林，周明慧，于亚平，张明华

（1. 昆山市第一人民医院临床实验研究中心，昆山 215300；2. 昆山市第一人民医院肝胆外科，昆山 215300）

胆管癌是一种预后极差的恶性肿瘤，在肝胆系统恶性肿瘤中发病率居第2位，且近年来有上升趋势。临床上绝大多数胆管癌是进展期胆管癌，缺乏有效的治疗方法，这是因为胆管癌对传统的抗肿瘤药物不敏感，应答率＜30%，患者中位生存时间＜12个月，中位无进展生存期仅为8个月[1-3]。近年来，肿瘤细胞糖代谢的研究取得了重要进展，发现肿瘤组织与正常组织细胞的能量代谢截然相反：肿瘤在正常氧分压的条件下，糖酵解活性显著增强，氧化磷酸化供能受到抑制，产生大量乳酸。研究表明，利用这种代谢差异，扰乱能量代谢过程，会对肿瘤细胞具有杀伤作用[4-5]。乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）是糖酵解的关键酶之一。目前，LDHA抑制剂草氨酸钠对胆管癌的作用效果鲜有报道。本研究用草氨酸钠体外干预人胆管癌细胞株Hucct-1，观察细胞自噬与凋亡的变化，为进一步进行动物体内研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胆管癌细胞株Hucct-1购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，LDHA小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购自广州锐博生物科技有限公司，草氨酸钠购自美国Sigma公司，兔抗人自噬相关基因7（autophagy-related gene 7，ATG7）单克隆抗体、兔抗人Beclin-1单克隆抗体、兔抗人P62单克隆抗体、兔抗人微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC-3Ⅱ）单克隆抗体、兔抗人LDHA单克隆抗体和兔抗人β-actin单克隆抗体均购自英国Abcam公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（1︰2 000）、乳酸检测试剂盒、CCK8检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和RIPA裂解液均购自上海碧云天生物科技有限公司，TRIzol试剂、LipofectAMINE 2000购自美国Thermo公司、RPMI 1640培养液、Opti-MEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清和PBS均购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组与转染 人胆管癌细胞Hucct-1用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、含5% CO2的平衡湿度培养箱中培养。当细胞融合度为70%～80%时进行消化传代，按所需密度接种于细胞培养板。

实验分为正常对照组、草氨酸钠组和LDHAsiRNA组。将处于对数生长期的细胞接种于6孔板（5×104个/孔，每组3个复孔），培养至细胞密度为50%～60%时，进行siRNA转染。将siRNA（每孔100 pmol）和LipofectAMINE 2000（每孔4µL）分别用Opti-MEM培养液稀释至100 µL，将两种稀释液混合，避光孵育30 min后，将混合液加入到含Hucct-1细胞的6孔板中，每孔200 µL；每孔再加1.8 mL Opti-MEM培养液，培养6 h后更换RPMI 1640培养液，继续培养48 h。草氨酸钠组应用0、25、50、100和200 mmol/L的草氨酸钠作用48 h后，进行后续实验。正常对照组加正常培养液培养48 h。

1.2.2 荧光定量PCR 收集上述分组处理过的细胞，按TRIzol试剂盒说明提取细胞总RNA，用酶标仪测定RNA的浓度和纯度后，用DEPC水将RNA稀释至终质量浓度为1 µg/µL，取1 µL进行反转录合成cDNA，反应条件为55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后取2 µL cDNA进行实时荧光定量PCR，反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR引物序列如下：L D H A基因上游引物序列为5'-ATGAAGGA-CTTGGCAGAT-3'，下游引物序列为5'-TGACA-GCTTAATGGGTGA-3’；内参β-actin基因上游引物序列为5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3'，下游引物序列为5'-CTCAGTGTAGCCCAGG-ATGC-3'。以GAPDH为内参，应用2-△△Ct法计算LDHA的相对表达量。

1.2.3 蛋白质印迹法检测LDHA及细胞自噬相关蛋白表达 细胞接种于6孔板，按上述分组处理结束后，PBS洗涤，用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测各组蛋白浓度。取20 g蛋白以80 V 15 min后转110 V进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后以110 V、1.5 h电转移至聚偏二氟乙烯膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。加入兔抗人ATG7、Beclin-1、P62、LC3-Ⅱ、LDHA和GAPDH抗体（工作液稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶2 00 0），常温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min。最后用化学发光法显色，观察并分析目的蛋白条带与内参β-actin条带的灰度值之比。

1.2.4 CCK8法检测细胞活力 细胞接种于96孔板，按上述分组处理结束后，设置空白对照孔和不同浓度（0、25、50、100和200 mmol/L）的草氨酸钠组，每组6个重复孔。各组细胞作用结束前2 h，每孔加入10 µL CCK8试剂，孵育1～3 h，应用全波长酶标仪检测波长450 nm时的各组吸光度，细胞活力以加药孔吸光度减去空白对照孔吸光度的差值来表示。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 Hucct-1细胞干预结束后，预冷的PBS洗涤细胞2次，离心后重悬于400 µL凋亡试剂盒缓冲液中。加入5 µL A nn exinⅤ-异硫氰酸荧光素（f lu o re s c ei n isothiocyanate，FITC），室温避光孵育5 min。然后加入10 µL碘化丙啶（propidium iodide，PI），4 ℃避光孵育30 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 细胞迁移实验 细胞接种于6孔板，待细胞融合度为80%～90%时，尽量垂直于培养板用无菌移液枪尖划出一道痕迹，PBS洗涤细胞2次，除去漂浮细胞。置于37℃、含5% CO2的恒温箱中培养，按1.2.1节分组处理细胞，48 h后在光学显微镜下观察并拍照。通过测量划痕宽度的变化来分析各组细胞的迁移能力。

1.2.7 乳酸检测 细胞接种于6孔板，经上述分组处理结束后，收集细胞上清液，按乳酸检测试剂盒说明书依次加入上清液、酶工作液和显色剂，涡旋混匀，37℃孵育10 min，加入终止液终止反应。设置空白孔和标准孔，波长530 nm时测量各孔吸光度，绘制标准曲线，计算各组细胞中的乳酸含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。各实验均独立重复3次，结果数据用x-±s表示，多组比较采用方差分析，组内两两比较用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 草氨酸钠抑制Hucct-1细胞增殖

图 1 草氨酸钠对Hucct-1细胞活性影响Figure 1 Effect of sodium oxalate on Hucct-1 cell activity

Hucct-1细胞中分别加入0、25、50、100和200 mmol/L草氨酸钠作用48 h后，检测各组细胞的活性。结果（图1）显示，随着药物浓度的增加，细胞增殖活力显著降低（P＜0.001），呈明显的剂量依赖性。计算得到草氨酸钠的半数抑制浓度为50 mmol/L，后续实验中草氨酸钠组即用50 mmol/L的草氨酸钠干预细胞。

2.2 草氨酸钠抑制Hucct-1细胞中乳酸含量和LDHA表达

用50 mmol/L的草氨酸钠作用Hucct-1细胞24 h或转染LDHA-siRNA 24 h后，与不经任何处理的正常对照组比较，草氨酸钠组和LDHAsiRNA组乳酸含量均明显降低（P＝0.000 9，P＝0.000 8）（图2A），而LDHA的mRNA（P＝0.001 9，P＝0.001 4）和蛋白（P＝0.021 5，P＝0.004 3）表达水平均明显降低（图2 B～D）。

图 2 草氨酸钠和LDHA-siRNA对胆管癌Hucct-1细胞中乳酸含量和LDHA表达的影响Figure 2 Effects of sodium oxalate and LDHA-siRNA on the lactate content and LDHA expression in Hucct-1 cells

2.3 草氨酸钠对Hucct-1细胞凋亡的影响

AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡结果显示，草氨酸钠作用或LDHA-siRNA转染24 h后，草氨酸钠组（P＝0.000 2）和LDHA-siRNA组（P＜0.000 1）细胞凋亡率明显高于正常对照组（图3），说明通过抑制LDHA的表达可以诱导胆管癌细胞凋亡。

2.4 草氨酸钠对Hucct-1细胞迁移能力的影响

草氨酸钠作用或LDHA-siRNA转染48 h后，与正常对照组比较，草氨酸钠组（P＝0.001 3）、LDHA-siRNA组（P＝0.000 3）的Hucct-1细胞迁移距离均显著缩短（图4），表明草氨酸钠可以通过下调LDHA的表达抑制细胞迁移。

2.5 草氨酸钠对Hucct-1细胞自噬相关蛋白表达的影响

草氨酸钠干预或LDHA-siRNA转染48 h后，提取Hucct-1细胞总蛋白，蛋白质印迹法检测结果（图5A）表明，草氨酸钠组、LDHA-siRNA组细胞自噬相关蛋白A T G 7（P＝0.0 0 0 6，P＝0.000 1）、Beclin-1（P＝0.000 4，P＝0.003 3）和LC3-Ⅱ（P＝0.000 3，P＝0.000 3）表达水平均明显升高（图5 B、C、D），自噬底物蛋白P62（P＝0.000 9，P＝0.000 8）的表达水平明显降低，差异均有统计学意义（图5 E）。

图 3 流式细胞术检测草氨酸钠和LDHA-siRNA对胆管癌Hucct-1细胞凋亡的影响Figure 3 Effects of sodium oxalate and LDHA-siRNA on apoptosis of Hucct-1 cells were detected by flow cytometry

图 4 划痕愈合实验检测草氨酸钠和LDHA-siRNA对胆管癌Hucct-1细胞迁移的影响Figure 4 Effects of sodium oxalate and LDHA-siRNA on migration of Hucct-1 cells were detected by wound healing assay

图 5 蛋白质印迹法检测草氨酸钠和LDHA-siRNA对Hucct-1细胞自噬相关蛋白表达的影响Figure 5 Effects of sodium oxalate and LDHA-siRNA on Hucct-1 cell autophagy-related protein expressions were detectef by Western blotting

3 讨论

细胞生长过程都是以能量代谢为基础。正常的组织细胞在缺氧环境下，可激活糖酵解代谢途径，LDHA表达增高，应用糖酵解提供能量，产生大量的乳酸。在正常氧分压或缺氧条件下，肿瘤细胞过量摄取葡萄糖后，糖酵解途径激活，有氧供能受到抑制，产生大量乳酸，这种现象称为“Warburg效应”[6-7]。肿瘤的生长速度、恶性程度与能量代谢密切相关。研究表明，利用肿瘤细胞与正常细胞的代谢差异，扰乱其能量代谢过程，会对肿瘤细胞具有杀伤作用，而不会影响正常细胞的代谢[8-9]，这为肿瘤治疗提供了新的策略。LDHA是能量代谢的关键酶之一。研究表明， LDHA在胆管癌组织和胆管癌细胞中的表达水平升高[10]，说明LDHA与胆管癌的发生与发展相关。

胆管癌的发病机制复杂，与多种抑癌基因的失活、原癌基因的激活以及其他特殊的微环境相关，胆管癌组织中的2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖显著增加，提示胆管癌细胞代谢具备Warburg效应[11]。胆管癌的生长可能更加依赖肿瘤细胞的Warburg效应，因此可以推断，干扰胆管癌特有的能量代谢途径会抑制胆管癌的各种生物学行为，从而改善胆管癌患者的预后。LDHA主要催化糖酵解途径的丙酮酸转化为乳酸，产生ATP[12]；抑制LDHA必然会抑制胆管癌细胞的各种生物学行为；研究证实，阻断胰腺癌及乳腺癌等恶性肿瘤细胞的LDHA表达，可明显抑制这些肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡的发生[13]。本研究发现，LDHA表达下调后，明显抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，由此推测，LDHA有可能成为胆管癌治疗的新靶点。

草氨酸钠的化学成分为丙酮酸类似物，与丙酮酸竞争性地结合LDHA而抑制其催化活性。作为一种新型的抗肿瘤药物，草氨酸钠具有广泛的应用前景。鉴于LDHA在肿瘤细胞Warburg效应中的关键作用，本研究发现草氨酸钠可通过阻断LDHA的酶活性，抑制胆管癌细胞增殖，促进其凋亡发生。细胞自噬在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，自噬与凋亡是影响肿瘤的重要因素，调节自噬影响肿瘤细胞的生存与凋亡。目前，部分科学家认为，肿瘤细胞可以依赖细胞自噬维持细胞稳态，以抵抗放疗和化疗药物的压力，同时维持肿瘤细胞内蛋白质和细胞器的更新，防止DNA损伤[14]。本研究在细胞水平证实，应用草氨酸钠干预胆管癌细胞后，细胞凋亡率升高，细胞自噬相关蛋白ATG7、Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平明显升高，自噬底物蛋白P62表达水平下降。本研究发现草氨酸钠可以激活细胞自噬，促进细胞凋亡。草氨酸钠作为新型的抗肿瘤药物，其确切机制尚未明确。本研究组将继续通过动物体内实验探究草氨酸钠诱导胆管癌细胞凋亡的分子病理机制。