CDK4、CyclinD1、P16在肺小细胞癌中的表达及意义

陈 威，谭敏华，黄文彦，周泳健，欧瑞芬

肇庆市第一人民医院病理科，广东 肇庆 526000

肺小细胞癌（Small cell lung cancer, SCLC）是一种恶性肿瘤疾病，该病的疾病进展快且自然病程短［1］。针对SCLC 这一类型的疾病，尽早的诊断疾病具有重要意义。关于SCLC 的诊断，研究表明对癌基因进行检测具有重要意义，在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 蛋白均是引起肺癌发生的主要基因产物，通过对上述三种基因产物进行检查，对在其检出SCLC有重要意义［2］。SCLC有明显的神经内分泌分化特征，属于神经内分泌性肿瘤，其中CgA、CD56、Syn等是常见的神经内分泌抗体，在SCLC等神经内分泌分化性肿瘤的病理诊断中有着十分重要的作用。本次研究中，就具体探讨了在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 的表达情况，以为疾病的早期诊断及治疗提供满意参考，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

本次研究中选取2010 年8 月—2019 年12 月收治的80例SCLC 患者为研究对象，35 例非肺癌组织为对照。肺癌病理组织均参照世界卫生组织中的肿瘤分型，均是穿刺活检组织病例。80 例SCLC 的基本资料如下：男性63 例，女性17例；年龄39～86岁，平均年龄（63.2±2.3）岁。35例非肺癌组织材料均选取自肺大疱、肺出血的患者。

1.2 检测方法

采取免疫组化进行标本的染色，操作步骤主要如下：（1）对于穿刺活检病理切片组织，均应用福尔马林进行固定并且使用石蜡进行包埋，将组织切片制成5 μm的切片，用二甲苯进行脱蜡，每次10 min，总共两次，用100%、95%、80%、70%不同梯度的乙醇进行水化，每一个梯度的水化时间均为5 min，蒸馏并且使用水洗5 min 每次，持续水洗两次。（2）配制新鲜的浓度为3%的过氧化氢溶液，使用这一溶液来封闭内源性过氧化酶的活性，在室温下放置15 min后用蒸馏水水洗5 min。（3）组织切片置入搭配0.01M 的枸橼酸钠抗原修复液中，修复液的PH 值为6.0，使用高压进行抗原修复3 min，取出后冷却到室温下取出组织切片。（4）使用浓度为5%的非免疫羊血清，在37 ℃的温度下孵育20 min，封闭以免发生非特异性抗原反应。（5）使用滤纸将多余的血清吸除，加入第一个抗体在玻片上，P16作为第一抗体，将该抗体放在4 ℃的冰箱过夜，CDK4、CyclinD1 一抗则置入37 ℃的环境中孵育120 min，PBS洗5 min，总共3次。（6）加入生物素标记二抗，比值1:200，抗体置入到37 ℃的环境中30 min，PBS 洗5 min。持续3次。（7）加入经标记后的过氧化酶的链酶索-亲和素复合物（1∶150），在37 ℃的环境下放置30 min，PBS 洗5 min，持续3 次。（8）新鲜配备的DAB 于显微镜下检测进行显色，在合适的时间停止进行显色，显色后使用自来水进行冲洗。（9）应用Harris苏木素对细胞核进行染色，应用1%的盐酸酒精进行分化，之后充分进行水洗以返蓝，在梯度酒精下充分脱水，之后用树胶进行封片。

1.3 观察指标

以细胞核出现棕黄色的免疫沉积物判定呈阳性，借助双盲法，计数10 个高倍视野，按照切片中阳性细胞比作，观察同种类型细胞数所占百分比及阳性细胞着色强度。依据切片阳性细胞占据观察的同类细胞数百分比、阳性细胞着色强的指标，以切片中阳性细胞占计数细胞百分比进行分级，分级具体如下：小于5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2分，大于51%为3分。显色程度判断阳性强度，基本不着色为0分，着色呈淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3 分。每张切片着色程度得分同着色细胞百分比相乘，其中0～1 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～6 分为中等阳性（++），6 分以上为强阳性（+++），弱阳性也纳入阳性判定中。

1.4 统计学方法

使用SPSS 21.0 软件做统计学结果分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验；计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCLC与正常组织CDK4、CyclinD1、P16的比较

三种蛋白行免疫组化染色，在CDK4、CyclinD1、P16检出的阳性率上NSCLC组织要明显高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 CDK4、CyclinD1、P16蛋白免疫组化检测结果 例（%）

2.2 SCLC 患者中CgA、CD56、Syn 等神经内分泌抗体的表达

CgA、CD56、Syn的阳性表达情况，见表2。

表2 SCLC患者中CgA、CD56、Syn等神经内分泌抗体的表达 例（%）

2.3 CDK4、CyclinD1、P16表达与神经内分泌表达相关性

CDK4、CyclinD1 与CgA、CD56、Syn 表达呈正相关（P＞0.05），P16 表达与CgA、CD56、Syn 表达呈负相关（P＜0.05），见表3。

表3 CDK4、CyclinD1、P16表达与神经内分泌表达相关性

3 讨论

SCLC 是起源于支气管黏膜或腺体的肺癌疾病，该疾病的致死率非常高，因此早期诊断疾病非常关键［3］。对SCLC 疾病，穿刺活检组织病理学检查一直都是临床诊断疾病的金标准，而一般进行这种检测的时候，患者也常会出现典型的表现，且确诊患者也多处在肺癌中晚期阶段［4］。为了提高肺癌的早期检出率，需要探讨更加有效的检测手段。

对于SCLC，研究表明此类患者CDK4、CyclinD1、P16 表达水平会出现明显的改变，因此对这几种物质进行检测也就成为了SCLC 检测的一种新的手段［5］。CDK 属于周期蛋白依赖性蛋白激酶，该物质可以通过对丝氨酸/苏氨酸蛋白的化学作用来驱动细胞周期，这属于细胞周期中的重要调控因子［6］。CDK 活性依赖正调节亚基Cyclin 顺序性表法及负调节亚基，且该物质的活性还受磷酸化与去磷酸化，对癌基因及抑癌基因进行调节，CDK家族包括1～8种亚型，CDK4 为其中的一种亚型。CyclinD1 主要为细胞周期素D1，细胞周期为连续性过程，而其中部分时间限制点对多个控制细胞周期的进程有满意的调节作用，CyclinD1 在细胞周期中，同特异CDK 形成复合物，这样可以调节CDK 的活性，且CyclinD1复合物也可同pRb蛋白进行结合，一同在癌细胞周期中发挥作用［7］。P16 是肿瘤细胞中常见的抑基因，这一蛋白属于细胞周期素依赖激酶抑制物，可同CyclinD1 竞争性结合为CDK4，P16 同CDK4 进行稽核，会使CDK4 的活性受有效抑制，使得CDK4 无法解除pRb 蛋白对于转录因子的抑制，这样可组织细胞的生长及分裂［8］。在正常的情况下，机体组织中的CDK4、CyclinD1、P16 不表达，而在发生癌变后这些物质就会出现表达异常的情况，且随着癌症的持续进展，表达水平也会持续升高，这为SCLC 的早期检出提供有利帮助。在本次研究中，选取了SCLC 患者组织及非肺癌患者组织进行了染色及检测，结果显示在对CDK4、CyclinD1、P16 各物质检出阳性情况上， SCLC 检出各物质的阳性率上要显著高于正常组织。而作为一种神经内分泌性肿瘤，CDK4、CyclinD1、P16 与其常见的神经内分泌分化肿瘤标志物CgA、CD56、Syn 等有何关系，是将来临床SCLC 早期诊断研究的一个方向，对该病的诊断检查有十分重要的意义。分析CDK4、CyclinD1、P16 与神经内分泌抗体的相关性发现，CDK4、CyclinD1 与CgA、CD56、Syn 表达呈正相关，P16表达与CgA、CD56、Syn 表达呈负相关，这能够为临床SCLC的早期诊断提供新的有利参考。

综上所述，相较于正常的机体组织，在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 的表达水平高，在进行肺癌的诊断过程，采取免疫组化染色及检测以上三种物质的方式，可以为SCLC 的早期诊断提供有利的帮助，进而为其治疗提供参考，因此值得在临床中推广使用。