桶装水中铜绿假单胞菌污染原因及检测方法

杨丰旭

朝阳市检验检测认证中心 辽宁朝阳 122000

近年来，人们对桶装饮用水的需求不断增加，饮用水的安全问题引起了人们的广泛关注。国标限量值要求桶装水中铜绿假单胞菌不得检出，但近期随着多地发生了桶装水中铜绿假单胞菌超标的问题，让消费者不得不重新审视桶装水的质量问题。铜绿假单胞菌作为水源性致病菌的主要来源之一，是一种条件致病菌，它在各种水、空气、人的皮肤、呼吸道和肠道等都能存活，一些免疫力低的人群喝了受其污染的水后可能会导致疾病的发生。

1 桶装水铜绿假单胞菌产生的主要原因

1.1 水源水污染因素

水源水污染是桶装水被污染的根本原因。桶装水的主要原料是自来水、井水或来自河流和湖泊的泉水，这些年随着经济的快速发展，大量没有处理达标的工业废水和生活污水经常污染水源水，若水源水受到污染且无法通过后续过程清除，则很可能会发生连续污染。例如一些桶装矿泉水生产时为了保证矿物质含量，没有使用精滤装置，就使得铜绿假单胞菌有机会透过。

1.2 企业卫生意识不强，设备消毒不彻底

一些企业设备和生产工艺简陋，控制铜绿假单胞菌污染的发生有一定难度。由于用于生产的仪器设备接口很多，在生产过程中容易发生交叉污染，使病菌进入最终产品。铜绿假单胞菌可粘附于管道、滤膜、贮水池及增压泵中繁殖，简单的冲洗无法彻底清除。同时，如果生产设备没有定期消毒、消毒不彻底或消毒剂不合格，也容易引起铜绿假单胞菌污染。此外，传统的消毒方式，如臭氧浓度低及短时间接触冲洗无法完全杀灭，周而复始，污染不断加剧[1]。

1.3 包装材料清洗消毒不到位

通过对水源、生产过程、存储容器和生产环境的分析，对桶的清洁和消毒被认为是成品水污染的主要原因。目前多数桶装水制造商普遍回收水桶，而水桶的特殊结构不利于清洁消毒。铜绿假单胞菌属于人类皮肤污染指示菌，一些小型企业生产技术相对落后，仍采用人工手动灌装密封及清洁工作，导致了污染的发生。在灌装前，如果消毒剂的浓度过低、消毒时间不足或消毒方法不当，则无法有效杀死微生物，桶中的残留物可能引起交叉污染。

1.4 缺乏自检及运输过程监控

目前，大多生产企业缺少专业的检测人员和设备，不能对产品进行有效的测试。在生产、储存和运输过程中，水盖的质量不达标也会导致污染。例如桶的顶盖被多次拉动，容易使顶盖松动和泄漏而引起污染。如果对后期的运输和销售缺乏监控，就会导致被污染的桶装水进入市场[2]。

2 桶装水铜绿假单胞菌检测方法

2.1 国标法

国标规定用GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》来检测桶装水中铜绿假单胞菌。该方法是将250mL水样用0.45μm滤膜过滤后移至CN琼脂培养基上，经一定条件培养后能在CN上生长并产生绿脓菌素或氧化酶阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌则可判定为铜绿假单胞菌阳性。

2.2 实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR法是根据铜绿假单胞菌外毒素 A 基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，对目标靶序列进行特异性扩增来检测铜绿假单胞菌的。该方法检测快速、特异性和灵敏性良好，为铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。

2.3 LAMP法

环介导等温扩增技术（LAMP）利用链置换DNA聚合酶在等温条件下进行反应，短时间内可完成核酸扩增。该法与国标法检验结果一致，但检验时间只需 2 h，并且可通过目测反应体系浊度变化或显色反应对结果进行判断。LAMP法成本低，省时且无需大型专业设备，扩增产物不需要繁琐的电泳过程，快速灵敏、特异性强，尤其适合即时、现场、大量的初筛工作，易于应用推广[3]。

2.4 酶底物法

酶底物法（Pseudalert）是采用特异性固定底物技术，目标细菌产生能够分解 Pseudalert 底物特定的酶，产生荧光，在24 h内即可得到结果，无需进行验证试验。该方法能够较好地弥补传统滤膜法在检测工作中的不足，在美国和欧洲部分地区已经被批准为检验铜绿假单胞菌的标准方法。

2.5 其他仪器检测方法

VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统准确率高，可以用于检测铜绿假单胞菌。近年来，还发展出使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）来检测铜绿假单胞菌的研究报道，可以为该菌的检测工作提供有效的借鉴及辅助。

3 结语

铜绿假单胞菌存在范围广、适应环境能力强、生长营养需求不高，能在许多污染物质中存活并繁殖，对人们的身体健康存在一定的危害。近年来桶装水中铜绿假单胞菌的污染问题逐渐增多，由此引发的食物中毒也时有发生，已成为公共卫生的重大隐患。相关企业在日常生产过程中应做好严格的消毒工作，必须采取果断而有效的方法来确保水质合格。另外，铜绿假单胞菌在利用水流甚至气溶胶传播时，比其他微生物种类有优势，故控制工艺中的污染时，空气净化也是重要环节。相信随着生产企业检测水平的不断提升和安全意识的不断增强以及检测方法的快速发展，桶装水中铜绿假单胞菌污染问题定能得到更加有效的解决，更好的保障人民群众饮水安全。