猪瘟病毒检测方法研究进展

王相森

（山东省高密市经济开发区畜牧兽医站山东潍坊 261500）

猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属成员，病毒基因组为单股正链RNA，近年来随着我国养猪业的快速发展，猪瘟的发病趋势呈现出了明显的变化，猪瘟发病后的临床表现往往不典型，出现了所谓的非典型猪瘟、温和型猪瘟等，仅通过临床特征很难进行确切诊断。本文主要综述了猪瘟病毒的几种实验室检测方法，为提高我国猪瘟病毒的实验室诊断提供参考。

1 RT-PCR 检测方法

RT-PCR 检测方法是猪瘟病毒的常用检测方法，该方法特异性强，敏感性高，检测结果快速准确[1]。猪瘟病毒基因组全长12.5kb，含有一个大的开放阅读框，5'端有一个非编码区（5'UTR），3'端有一个非编码区（3'UTR），通常根据猪瘟病毒5'端保守区序列设计通用型检测引物，根据变异性较强的E2 基因序列设计毒株分型鉴别检测方法。普通的RT-PCR 检测方法根据实验方法的不同又分为单重RT-PCR 方法和多重RT-PCR，单重RT-PCR 方法可以分为两步RT-PCR 方法、一步法RT-PCR 方法和巢式RT-PCR 方法，两步RT-PCR 方法的反转录和PCR 扩增分步进行，一步RT-PCR 方法是利用一步法酶在一个体系内先进行反转录再进行PCR 扩增，大大简化了试验流程，缩短了试验时间，巢式RT-PCR 方法通过两轮PCR 扩增增加了试验的灵敏性，多重RT-PCR 方法是同时进行多种病原的PCR 检测，由于临床病料的混合感染情况较严重，通过多重RT-PCR 同时实现多种病原的同时检测，节约了试剂和试验时间，在临床病料检测中可以根据需要选择适合的检测方法。

2 RT-LAMP 检测方法

RT-LAMP 检测方法是核酸的恒温扩增检测方法，该方法敏感、特异、方便、快捷，适用于基层实验室猪瘟病毒的检测。王韦华[2]等建立了猪瘟病毒RT-LAMP 检测方法，根据GenBank 上不同猪瘟分离株的基因组序列设计猪瘟病毒扩增引物，通过优化RT-LAMP检测条件，建立了猪瘟病毒RT-LAMP 检测方法，该检测方法的最低检测限量为1.0×10-7 ng/μ L，比普通RT-PCR 方法的敏感性高100 倍，为猪瘟病毒的现场快速诊断提供了方便。杨平东[3]等建立了猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP 快速检测方法，该方法是利用核酸序列依赖性扩增技术（NASBA）大量扩增病毒RNA，在进行反转录环介导等温扩增（RT-LAMP），该方法是将NASBA 技术和RT-LAMP 技术相结合的两步法检测方法，大大提高了病毒RNA 检测的灵敏度，最低可以检测出46 pg/μL 的病毒RNA，为猪瘟病毒的临床检测提供了新思路。

3 IPMA 检测方法

IPMA 检测方法全称为免疫过氧化物酶单层细胞试验，是在感染病毒的单层细胞上面加上一抗，再加上标有辣根过氧化物酶的二抗，最后加上酶底物进行显色反应，通过抗原抗体的相互作用，产生特异性的显色反应，通过光学显微镜进行观察并判断结果。张振仓[4]等建立了猪瘟病毒的IPMA 检测方法，最佳病毒接种量为0.5 个TCID50，一抗1:300 稀释，二抗1:2000 稀释，检测方法有很好的特异性，与其他猪病毒没有交叉反应，在300 份临床样品的检测中，通过与RT-PCR 方法和ELISA 方法的比较，符合率在92%以上，说明该就检测方法有很好的特异性，敏感性，检测结果准确可靠，为猪瘟病毒的临床检测奠定基础。

4 实时荧光定量PCR 检测方法

实时荧光定量PCR 检测方法是近些年发展起来的病毒核酸低含量快速检测技术，操作方便，检测结果直观，检测时间短。张永英[5]等建立了猪瘟病毒强毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法，该方法根据猪瘟病毒强毒株5'UTR 区域设计特异性检测引物，可以快速检测猪瘟病毒强毒株，最低检出量为10 拷贝/μL，检测结果快速准确，与猪瘟弱毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒没有交叉反应，可以用于猪瘟病毒强毒感染的早期诊断和猪瘟的有效防控。

5 结语

猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，危害巨大，随着养殖规模的扩大，猪瘟病毒时刻发生变异，各种新流行毒株不断出现，临床症状往往不典型，大大增加了疾病诊断难度，加强猪瘟病毒的实验室检测对防控猪瘟扩散传播起到关键作用，随着分子生物学技术的迅猛发展，各种新技术，新方法不断应用到猪瘟的临床检测中，大大提高了检测的特异性和敏感性，为猪瘟病毒的综合防控和早期诊断带来方便和快捷，各种检测方法也可以用于猪场猪瘟病毒的净化，通过开展分子流行病学调查，及时淘汰带毒猪和隐性感染猪，为规模猪场的健康发展保驾护航。