基层兽医实验室开展PCR 检测的假阳性防范策略

2020-11-27吴玉疆杨丁

中国动物保健 2020年2期

关键词：枪头移液器试剂

吴玉疆，杨丁

（宜宾市动物疫病预防控制中心四川宜宾 644000）

目前，宜宾市市县两级共11 个兽医实验室均配置了荧光PCR仪，开展病毒核酸检测。检测过程中，出现过假阳性结果的情况，对检测造成了困扰。市动物疫控中心兽医实验室通过在工作中分析总结，对假阳性的防范有了一定心得，适用于基层施行，现交流如下。

1 基层兽医实验室开展PCR 检测出现假阳性的主要原因

1.1 意识不足，措施不够

基层兽医人员大多对PCR 检测技术了解较少，防范意识不足，也不知防范重点，加之日常工作事务繁杂，在检测工作中很容易忽略防范措施。

1.2 分区不当，硬件不足

宜宾市县级基层兽医实验室一般按照BLS-1 设置和分区，尚有几个未通过实验室考核，规范化水平不够。大多没有或仅有一间病原检测室，分区不够清晰，也没有气流压力系统，有的生物安全柜年久失修或没有配备，容易导致污染发生。

1.3 经验缺乏，操作不当

基层实验人员的PCR 检测操作经验少，不够熟悉，在处理、转移、加样等过程中均可能造成污染。加之目前检测试剂敏感性都较高，试剂、吸头、移液器、仪器等被污染，或是操作不当产生气溶胶等，均可导致假阳性结果。

2 基层兽医实验室开展PCR 检测的假阳性防范策略

检测结果的时效性不言而喻，基层兽医实验室若发生污染后再分析原因消除污染这一过程费时费力，因此，防范于未然显得特别重要。

2.1 合理分区，配置到位

PCR 检测需按照样品处理、试剂配制、加样、上机反应四个过程，在四个独立空间进行，且按此进行单向流向。结合宜宾市基层兽医实验室实际，样品处理（包括核酸提取）主要在生物安全柜内进行，暂时没有的可在通风橱或超净工作台中进行。加样在血清室中进行。试剂配制在相对独立区域或另外一个超净工作台进行，如果条件受限可以和加样安排在血清室的两个不同处且试剂配制区处于上风口。荧光PCR 仪放在病原室、仪器室或其他相对独立区域。

各区域根据空间大小安装1 组以上紫外灯（平均功率为1.5W/m3），建议配备一台移动紫外车。各区域物品专用，配备实验服、一次性手套、口罩、帽子、记号笔、带盖垃圾桶、清洁工具等。样品处理、试剂配制和加样区各按需配备一组移液器，如加样区最好0～10μL 和0～20μL 两个量程各一把，有移液器的区域都配备带盖废液缸。试剂要有专门冰箱存放，不能放入样品。

2.2 提高意识，规范操作

2.2.1 检测前准备进入前：有的基层兽医实验室离办公区很近，人员进出较为随意，应严格控制人员进出。进入实验室必须换鞋（或鞋套），穿工作服。有时检测人员会参与采样，当日应尽量不进入实验室，必须参与检测时，应洗手、清洗鞋底、清洁衣服，整洁后方可进入，必要时更换鞋子，戴工作帽。同时，在检测区域外用消毒剂喷洒样品外包装，对采血管、离心管等样品保存管外表面进行消毒后方可带入检测区域。

进入后：打开生物安全柜风机保持10min 以上再使用。柜内不放无关物品，可在台面上铺一层吸水性垫料，以防污染和产生气溶胶。检查废液缸中是否加入适量10%次氯酸消毒液，各垃圾桶内是否套上厚实垃圾袋。检查试剂、耗材、用具等是否到位，避免检测时来回“串室”取拿物品。检查台面是否洁净，空调开启后注意风速风向。

平时将EP 管、移液器吸头、吸头盒等封口放入柜内，避免开口敞放。新试剂可在干净区分装保存。

2.2.2 检测中操作换：佩戴合适的手套，宽松的手套容易沾染。检测过程中怀疑手套被污染时立即换掉。进出不同区域更换对应区域实验服（标记或用不同颜色实验服以便识别）、手套等。移液器和吸头、EP 管等耗材只在该区域使用。

慢：生物安全柜内操作时动作应轻缓，在台面中后部进行。移液器吸取时要轻缓，避免过快吸入内部污染或产生气溶胶，最好使用带滤芯的吸头。移液器从采血管等较深容器中吸取样品时，应倾斜容器，尽量不让前端接触容器内壁，若沾污应及时用酒精棉擦拭。从袋中取EP 管过程中，手不要触及管盖内侧，可用镊子夹取。样品管、试剂管拧盖时手与管盖接触面要少，管盖拧开后，倒放在桌面上。检测未完成前，其他实验人员不要大动作收拾、打扫等。盖：枪头盒用完立即关盖，避免吸完样品或阳性对照的枪头经过打开的枪头盒、还未盖口的PCR 管或试剂管盖。

离：试剂和样品在加样前必须离心到管底，特别是阳性对照，以免吸液时沾到移液器前端污染。

分：加样顺序按阴性对照-样品-阳性对照进行，分为洁净区、操作区和废弃区。左边为洁净区，放置吸头、EP 管、试剂、管盖等，中间为操作区，放置样品、加样板等，右边为废弃区，放置废液缸等。这样，加样时从左到右移动，避免来回污染。加样过程中的废吸头、废弃物等要放入废液缸内，且要保证能浸泡于消毒液中。

2.2.3 检测后处理整备：整理台面，用75%酒精和10%次氯酸擦拭消毒生物安全柜台面，风机运行至少10min 再关闭，并开启柜内紫外灯照射30min 以上，若是通风橱或超净工作台则用移动紫外灯照射60min 以上。台面、移液器等的表面同样可用酒精和消毒剂擦拭。样品、废弃物等高压灭菌处理，剪刀等消毒洗净后高压灭菌备用。PCR 反应管严禁开口也无需高压，及时清理出实验室。垃圾桶每日清倒更换新的垃圾袋，废液缸更换消毒液。打开各区的紫外灯照射1h 以上。值得注意的是，高压的主要作用是灭活病原而非清除核酸污染。

通风：样品处理间的开窗通风在检测后方可进行。除样品处理区外，其他检测区域如无核酸污染不用经常打开门窗通风，一般3～5d 换气1h。

日常维护中，实验地面、仪器表面、实验服等根据工作频率和检测结果消毒和清洁。墙面、地面用浸泡有效氯浓度0.5%消毒液的抹布或拖布擦拭，注意污染区和清洁区的抹布、拖布等不要混用。仪器表面和金属部件可用75%酒精消毒，非金属物件可用含2%～3%有效氯的次氯酸盐消毒，清水洗净或擦拭。

2.2.4 污染处理基层兽医实验室PCR 检测污染的原因主要是气溶胶、移液器、吸头、试剂等。一般污染可通过复检或小范围消毒、更换移液器、枪头、试剂等后重检排除。若上述处理无法消除，伴有假阳性不规律增多，应怀疑发生气溶胶污染，需暂停检测重点进行通风和清洁消毒处理，具体如下。

所有台面、地面、用具、仪器外表面等用10%次氯酸清洁，仪器内表面和非玻璃外表面、管架等用0.5%次氯酸清洁，清洗实验服，开窗大范围通风数天并每日紫外灯照射，更换枪头、试剂等。可选用核酸祛除剂，对重点区域进行喷洒。之后可通过环境监测（将配好的反应液开盖暴露于各监测点半小时后直接上机反应）验证污染是否消除。

3 保证基层兽医实验室PCR 检测准确性的几个要点

3.1 合理分区

合理分区是开展PCR 检测的前提。基层实验人员防污染意识不足，加之在不合理的分区内进行样品处理、试剂配制、加样等操作，污染风险较高。

3.2 重视细节

基层实验人员往往日常工作事务繁杂，检测过程中临时离开、接打电话等时有发生，而PCR 检测对注意力和操作要求较高，任何一个细节没到位，都可能造成结果不准确。如在开放环境进行样品前处理；天热时空调大风速来回吹；废液缸和垃圾桶不带盖或长期处于开盖状态；加样时让EP 管、枪头盒长期打开并处于下风向，或弃枪头时直接从打开的EP 管、吸头盒上面划过等。