308nm单频准分子光对人角质形成细胞活力及细胞因子分泌水平的影响＊

田蔚蔚 ，刘排 ，李光 ，朱永军 ，李娟

（1.江西省皮肤病专科医院，南昌 330001；2.广东省深圳怡禾星门诊部，深圳 518000）

白癜风是一种由于表皮和附属器部位黑素细胞(melanocyte，MC)特发性损害而致色素脱失的常见的获得性皮肤病。目前其发病机制尚不完全明确，且目前仍无令人满意的治疗方法。近年来国内外已有较多的临床研究证实308nm单频准分子光和308nm准分子激光对白癜风的治疗有效[1-4]。但其作用机制方面的研究较少，目前有研究显示308nm准分子激光治疗可能通过诱导皮损处T淋巴细胞凋亡[5]，降低CD4+和CD8+T细胞浸润，促进调节性 T细胞及皮损处 TGF-β（transforming growth factorβ，TGF-β）和 IL-10 的分泌[6]，影响角质形成细胞的活力及不同细胞因子的分泌水平等[7-9]刺激残存的黑素细胞聚集于外周毛囊外根鞘[10]；通过Wnt/β-Catenin信号通路刺激B16细胞的黑素生成[11]等发挥治疗作用。而对于目前应用更广、更适用于基层使用的308nm单频准分子光的机制研究尚不明确[12]。

本研究通过研究308nm单频准分子光照射后人角质形成细胞活力及其与黑素细胞形态功能调节相关的细胞因子如干细胞生长因子 （stem cell factor，SCF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、粒-巨噬细胞集落刺激细胞生长因子 （granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的分泌水平，来探讨308 nm单频准分子光对白癜风的可能治疗机制，并通过比较不同照射剂量、不同照射时间组的比较探索剂量、照射时间对疗效的可能影响，为308nm单频准分子光应用于白癜风临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 308nm单频准分子光治疗仪（美国威峰）、酶标仪（RT-6100，Rayto）、DMEM高糖培养基 （杭州四季青生物工程有限公司）、DMSO（Amresco公司）、0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（凯基生物有限公司）、青霉素链霉素混合液（索莱宝科技有限公司）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（BI生物有限公司）、24 孔培养板、96 孔培养板 （Corning公司）、Human bFGF ELISA检测试剂盒 （上海酶联）、Human GM-CSF ELISA检测试剂盒（上海酶联）、Human SCF ELISA检测试剂盒（上海酶联）。

1.2 人角质形成细胞的培养及分组 采用HaCaT人永生化角质形成细胞株 （南京凯基生物科技有限公司），加入含10%FBS的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3 MTT法测定细胞活力 将HaCaT细胞按5×103/孔的细胞密度接种于96孔板中培养24h，给予不同剂量（100 mJ/cm2、200 mJ/cm2、300 mJ/cm2、400 mJ/cm2、500 mJ/cm2、600 mJ/cm2） 的 308nm 单频准分子光单次照射，对照组不予照射。经照射后的细胞培养 24h后，每孔加入 50μL1×MTT，在 37℃孵育4h，吸出上清液，每孔加入 150μL DMSO，用平板摇床摇匀，用酶标仪在550nm波长处检测每孔的A值。

1.4 ELISA法检测细胞因子分泌水平 将HaCaT细胞按105/孔的细胞密度接种于24孔板中后，给予不同剂量（100mJ/cm2、200mJ/cm2、300mJ/cm2、400 mJ/cm2、500mJ/cm2、600mJ/cm2）的 308nm 单频准分子光单次照射，对照组不予照射，其后分别于6h、12h、24h、48h收集上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，450nm波长测各孔吸光度值，按照标准曲线计算细胞因子 （SCF、bFGF、GM-CSF）浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件的进行数据分析，细胞活力A值采用t检验，其余计量资料采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 308nm单频准分子光对角质形成细胞活力的影响 308nm单频准分子光不同照射剂量组与对照组的 A 值比较发现，100、200、300、400、500mJ/cm2五个照射剂量组的各组A值与对照组比较无显著性差异 （P＝0.429、0.682、0.823、0.538、0.671），而600 mJ/cm2照射剂量组的A值与对照组比较有显著性差异（F＝4.281，P＝0.015）。 （图 1）

图1 不同剂量308nm单频准分子光照射后的HaCat细胞活力曲线

2.2 308nm单频准分子光对角质形成细胞活力及其细胞因子分泌水平的影响 308nm单频准分子光照射后可促进角质形成细胞分泌SCF，不同照射剂 量 组 （0、100、200、300、400、500、600mJ/cm2） 的SCF 浓度有统计学差异（F＝12.992，P＝0.000），图 2提示在0-500 mJ/cm2范围内，随照射剂量的增多，分泌水平逐渐升高，但600mJ/cm2组分泌水平稍下降，其中 500mJ/cm2组明显较 100mJ/cm2（P＝0.004）、200mJ/cm2（P＝0.017）组刺激角质形成细胞分泌的SCF 浓度更高。不同照射时间组（6h、12h、24h、48h）的 SCF 浓度有统计学差异 （F＝5.502，P＝0.002），其中照射 24h、48h后的 SCF浓度较 6h更高 （P＝0.003、0.022）。

308nm单频准分子光照射后可促进角质形成细胞分泌 bFGF， 不同照射剂量组（0、100、200、300、400、500、600mJ/cm2） 的 bFGF 浓度有统计学差异（F＝46.967，P＝0.000），图 3 提示在 0-400 mJ/cm2范围内，随照射剂量的增多，分泌水平逐渐升高，但500mJ/cm2、600mJ/cm2组分泌水平稍下降，其中 400mJ/cm2组明显较其他组（0、100、200、300、500、600mJ/cm2）刺激角质形成细胞分泌的SCF浓度 更 高 （P ＝0.000、0.000、0.000、0.004、0.004、0.000）。 不同照射时间组（6h、12h、24h、48h）的 SCF浓度有统计学差异（F＝3.892，P＝0.012），其中照射12h 后的 bFGF 浓度较 6h、48h 更高 （P＝0.002、0.040）。

图3 不同剂量308nm单频准分子光照射后的HaCat细胞分泌bFGF浓度变化

308nm单频准分子光照射后可促进角质形成细胞分泌GM-CSF，各照射剂量组的GM-CSF浓度高于非照光组（P＜0.05），但不同照射剂量组的组间差异并无统计学意义 （F＝8.615，P＝0.212）， 图 4提示500mJ/cm2组分泌水平稍高于其它照射剂量组（100、200、300、500、600mJ/cm2），但并无统计学差异（P＝0.079、0.591、0.887、0.105、0.481）。 不同照射时间组（6h、12h、24h、48h）的 SCF 浓度有统计学差异（F＝3.920，P＝0.012），照射 12h 浓度达到高峰值，高于 24h照射组（P＝0.037），但与其它时间点（6h、48h）无统计学差异（P＝0.995、0.574），但照射24h 后的 GM-CSF 浓度较 6h、12h 低 （P＝0.044、0.037）。

3 讨论

图4 不同剂量308nm单频准分子光照射后的HaCat细胞分泌GM-CSF浓度变化

目前白癜风尚缺乏疗效满意的治疗方案。而自从2003年Leone G等首次报道了308nm准分子激光在37例白癜风患者中的有效应用后[13]，其后多项研究亦证实308nm准分子激光及单频准分子光在白癜风治疗中的有效性[1-4]，且其较其他光疗方法（PUVA、NB-UVB）更为有效，着色更快，累积剂量更小，且不良反应如对周围正常皮肤的刺激性、致癌性等均较小[4]。同时其亦可有效应用于其它色素异常性疾病，均从侧面验证其促进黑素生成的作用[14]。目前308nm准分子激光及单频准分子光已纳入白癜风的一线治疗方案中。

308nm单频准分子光及308nm准分子激光虽波长相同，但是两者所用机器不同，辐射特性、发光方式亦有差异。Duff等一项随机对照试验显示，两者在白癜风治疗中的疗效类似[15]，且308nm准分子激光的费用较308nm单频准分子光约贵十倍，因此后者较前者应用性更为广泛，尤其适用于基层医院。目前308nm单频准分子光的机制研究尚欠缺。张勇等发现308nm单频准分子光可以使角质形成细胞分泌的SCF转录水平和蛋白水平表达均增加，其可能通过促进角质形成细胞SCF的表达而对白癜风起到治疗作用[12]。

本研究提示308nm单频准分子光照射剂量在100-500mJ/cm2之间时并未影响角质形成细胞的活力，但600mJ/cm2的照射剂量下，角质形成细胞活力稍下降，该研究结果与其它研究中的308nm单频准分子光及308nm准分子激光类似[8，12]，而与NB-UVB的研究相比较，其影响角质形成细胞活力的照射剂量更高，可能由于308nm单频准分子光和308nm准分子激光较其他光疗方法如NBUVB光谱更窄，也可能解释了308nm单频准分子光及308nm准分子激光较其它光疗方法如NBUVB副作用如红斑效应、致癌性更小。

本研究测定细胞因子的分泌水平结果提示308nm单频准分子光可促进角质形成细胞分泌SCF、bFGF、GM-CSF三种细胞因子，SCF参与正常黑素细胞功能的表达，可与表达于黑素细胞上的配体KIT结合，活化酪氨酸激酶通道，对黑素细胞的发育、增殖、分化和黑素的合成发挥着重要作用[7，9，12]。GM-CSF 在 UVA 诱导的色素沉着中作为黑素细胞的一种内在刺激物，能诱导受UVB照射的角质形成细胞增殖和分化[9，16]；bFGF则是MC的自然促分裂因子和天然丝裂原，可激活蛋白激酶2，促进MC进入S期，诱导MC的增殖分化和黑素的合成[8，9]。

不同照射剂量组的对比结果提示400-500mJ/cm2范围内SCF、bFGF的分泌水平随着照射剂量的增加而增多，该检查结果与既往308nm准分子激光的研究结果部分相符[7-9，12]，其与临床上观察到的治疗效果随照射剂量的增加而增强的情况相符，600mJ/cm2组分泌水平开始下降，不排除与细胞活力下降有关。而本实验为体外细胞研究，细胞活力受损后其余细胞增殖代偿情况体外与体内有异，因此在临床上患者出现副作用如水疱形成时的治疗剂量与体外实验观察到的细胞活力受损的照射剂量并不相符，但可以推测在细胞活力严重受损（患者出现明显副作用）之前，为提高治疗效果，可逐渐提高照射剂量。而各照射剂量组之间的GM-CSF的分泌水平比较结果提示，虽500mJ/cm2组稍高于其他剂量组，但差异并无统计学意义，结合既往308nm准分子激光的研究结果，在今后关于治疗机制的进一步体外实验研究中更推荐使用SCF、bFGF两种因子而非GM-CSF。

而不同照射时间组的对比研究提示在照射后的12-24h细胞因子分泌水平达高峰期，其后渐下降，因此在临床治疗过程中推荐治疗间隔时间为2-3d，其治疗效果明显优于一周一次的治疗间隔[3，4]。

因本实验仅检测细胞上清液中的分泌型细胞因子水平，仅提示角质形成细胞经308nm单频准分子光照射后，释放分泌型细胞因子的能力，而对于细胞型细胞因子的水平、细胞因子的mRNA表达水平等方面的探索尚需进一步的研究证实。