响应面法优化鲁氏酵母菌与植物乳杆菌复配培养条件

赵家圆，高绍金，李艳青，韩齐

(黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319)

肉制品在发酵过程中，发生一系列生物化学变化。原料肉通过有益微生物的作用，如乳酸菌、酵母菌等，可以改善产品质地，提高食品安全性，增强蛋白质的吸收率[1,2]，最终使发酵肉制品具有高营养、高品质、风味独特和贮存期较长等优点。

酵母菌是一种单细胞真核微生物，在传统发酵制品中，鲁氏酵母菌广泛存在于豆酱、酱油等酿造产品中，也是在酿造过程中影响风味品质的重要微生物[3,4]。鲁氏酵母菌经降解产生大量糖类营养物质，并伴随产生高级醇、芳香杂醇类和呋喃酮类化合物，为发酵肉制品提供增香作用。有研究发现酵母菌还具有抗氧化活性，能够保护肝脏[5]。酵母菌中的微量元素还具有抗衰老、抗肿瘤、预防癌症、提高人体免疫力的作用[6]。酵母菌在生长繁殖过程中产酸能力弱，不具备还原硝酸盐的能力，能够降低肉中微生物菌群的硝酸盐还原能力。

植物乳杆菌是一种广泛存在于发酵产品中的可食用微生物，其具有较高的安全性和功能性[7]。目前，植物乳杆菌生理功能的研究已有较多报道，在降低胆固醇、抗氧化、抑制血管紧张素转换酶活性、抑制食源性病原菌等方面均有较好的能力[8-11]。本试验所采用的鲁氏酵母菌和植物乳杆菌在前期试验中均表现出较好的发酵性能，并且对发酵肉制品的风味改善有一定的积极作用，前期试验中已经证明了鲁氏酵母菌和植物乳杆菌的安全性[12]。因此，本试验在单因素试验基础上进行Box-Behnken试验设计，以培养温度、培养时间和复配比例为变量，以pH值和菌落总数为响应值，优化鲁氏酵母菌和植物乳杆菌复配发酵剂的制备工艺条件，以用于发酵肉制品的生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲁氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii，保藏编号CICC32899)：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)：分离自发酵风干肠，由东北农业大学微生物实验室分离并保藏。

MRS肉汤、MRS琼脂培养基、YPD液体培养基、营养琼脂培养基：均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1 FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SHP-250型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；DELTA-320型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LDZX-50 KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

将鲁氏酵母菌及植物乳杆菌分别接种于YPD液体培养基和MRS液体培养基中。鲁氏酵母菌于28 ℃恒温培养箱中振荡培养(180 r/min)30 h，以2.0%的接种量传代2～3次至活力恢复，鲁氏酵母菌数至108CFU/mL备用。植物乳杆菌于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h，以2.0%的接种量传代2～3次至活力恢复，植物乳杆菌菌数至108CFU/mL备用。

1.3.2 拮抗试验

在无菌条件下，将植物乳杆菌划线接种于营养琼脂培养基上，在恒温培养箱中培养(32 ℃，24 h)，将鲁氏酵母菌垂直交叉鲁氏酵母菌划线于营养琼脂培养基上，在恒温培养箱中培养(28 ℃，72 h)。观察垂直交叉处是否有抑菌区域或菌落萎缩现象的产生。

1.3.3 单因素试验

培养温度的选择：将鲁氏酵母菌和植物乳杆菌分别以1%的接种量接种于营养肉汤培养基中，在恒温培养箱中培养24 h，培养温度分别为20，22，25，28，30 ℃，检测发酵液的pH值及菌落总数的变化。

培养时间的选择：将鲁氏酵母菌和植物乳杆菌分别以1%的接种量接种于营养肉汤培养基中，在恒温培养箱中于22 ℃条件下分别培养12，24，36，48，60 h，检测发酵液的pH值及菌落总数的变化。

复配比的选择：将鲁氏酵母菌和植物乳杆菌分别以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例接种于营养肉汤培养基中，接种总量为2%。在恒温培养箱中培养(22 ℃，24 h)，检测发酵液的pH值及菌落总数的变化。

1.3.4 响应面法优化鲁氏酵母菌与植物乳杆菌复配的最佳培养条件

在单因素试验基础上，采用Design-Expert V8.0.6.1软件中的Box-Behnken试验设计，以培养温度(A)、培养时间(B)和复配比(C)为变量，以pH值(Y1)和菌落总数(Y2)分别为响应值进行三因素三水平的响应面设计试验，并进行回归分析及显著性检验，最终分析确定鲁氏酵母菌与植物乳杆菌复配的最佳培养条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平

1.3.5 pH值的测定

1.3.6 菌落总数的测定

根据GB 4789.2-2016菌落总数测定方法，取1 mL发酵液加入9 mL无菌生理盐水中进行连续梯度稀释，选取适宜的3个梯度进行计数，采用营养琼脂培养基进行平板涂布，待培养基凝固后于恒温培养箱倒置培养48 h后计算菌落总数。

1.4 数据统计与分析

所有试验重复3次，每组3个平行，数据均表示成Mean±SD，采用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面分析，回归方程方差分析显著性检验。采用Statistix 8.0软件对试验数据进行差异显著性分析(P<0.05)，采用Sigmaplot 12.5软件进行绘图。

2 结果分析

2.1 拮抗试验

图1 鲁氏酵母菌与植物乳杆菌的拮抗试验

本试验所采用的植物乳杆菌分离自传统发酵风干肠，鲁氏酵母菌在前期试验结果中表现出了良好的呈香作用，二者的添加有助于改善发酵肉制品的品质，促进风味物质的形成。在前期试验中对植物乳杆菌及鲁氏酵母菌的安全性能及发酵性能进行了检验，结果表明二者安全性较高，且具有良好的发酵性能，可以应用于发酵肉制品的生产中。将两种不同的微生物发酵剂复配用于发酵肉制品生产的前提使二者能够共存，本研究对鲁氏酵母菌及植物乳杆菌进行了拮抗试验。由图1可知，在营养琼脂培养基表面，鲁氏酵母菌及植物乳杆菌菌落生长良好，交叉处没有明显的抑制现象或菌落萎缩，说明所用鲁氏酵母菌与植物乳杆菌间无拮抗作用，可以用于后期复配发酵试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 培养温度的影响

将鲁氏酵母菌和植物乳杆菌分别以1%的接种量接种于营养肉汤培养基中，分别于20，22，25，28，30 ℃条件下恒温培养24 h，检测培养终点发酵液的pH值及菌落总数。由图2可知，发酵液pH值呈先降低后升高的趋势，菌落总数呈先升高后降低的趋势。在22 ℃培养温度下，发酵液pH值最低，这是因为L.plantarum在培养过程中生长繁殖生成乳酸等有机酸导致的[13]，而菌落总数最高，说明22 ℃条件下Z.rouxii和L.plantarum的生长状态良好，且L.plantarum的产酸能力并没有受到限制，较低的pH值有助于促进发酵肉制品的成熟，抑制有害微生物的生长。随着培养温度升高至25 ℃，发酵液pH值升高，菌落总数降低，这可能是由于培养温度接近Z.rouxii的最适生长温度(28 ℃)，Z.rouxii开始快速生长繁殖从而导致发酵液pH值升高。当培养温度升高至30 ℃时，pH值快速升高，菌落总数趋于平衡，这可能是由于前期Z.rouxii的大量生长繁殖抑制了L.plantarum的生长。因此，当培养温度在20～25 ℃范围内，Z.rouxii和L.plantarum的生长繁殖不受到抑制，确定Z.rouxii和L.plantarum复配发酵液的最优培养温度为22 ℃。

2.2.2 培养时间的影响

Research on establishment of medical &nursing organizations for the elderly in Qingdao

图3 培养时间对发酵液pH值及菌落总数的影响

将鲁氏酵母菌和植物乳杆菌分别以1%的接种量接种于营养肉汤培养基中，于22 ℃条件下分别恒温培养12，24，36，48，60 h，检测培养终点发酵液的pH值及菌落总数。由图3可知，当培养时间在12～24 h范围内，pH值轻微下降，菌落总数升高，这可能是由于L.plantarum生长繁殖产生有机酸导致的，并且Z.rouxii也具有较好的生长状态。当培养至36 h时，pH值快速升高，而菌落总数快速降低，说明Z.rouxii的生长繁殖速度超过了L.plantarum，开始抑制L.plantarum的生长繁殖。当培养至60 h时，pH值和菌落总数均呈升高趋势，这可能是由于此时L.plantarum的生长繁殖已经进入了衰亡期，而Z.rouxii的生长繁殖尚未结束成为优势菌群导致的。因此，24 h为Z.rouxii和L.plantarum的最适培养时间。

2.2.3 复配比例的影响

图4 复配比例对发酵液的pH值及菌落总数的影响

将Z.rouxii和L.plantarum分别以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例接种于营养肉汤培养基中，接种总量为1%，22 ℃条件下恒温培养24 h，检测培养终点发酵液的pH值及菌落总数的变化。由图4可知，当Z.rouxii和L.plantarum的复配比例由3∶1降低至2∶1时，发酵液的pH值升高，但菌落总数增加并不显著(P>0.05)，说明Z.rouxii的生长繁殖情况优于L.plantarum，Z.rouxii是优势菌群。当Z.rouxii和L.plantarum的复配比例为1∶1时，pH值显著降低(P<0.05)，菌落总数轻微升高，说明当Z.rouxii和L.plantarum复配比例为1∶1时，二者均能稳定生长，无抑制作用。当Z.rouxii和L.plantarum的复配比例变至1∶2和1∶3时，pH值显著降低(P<0.05)，菌落总数先降低后升高，这可能是由于L.plantarum的添加比例上升后大量生成有机酸造成pH值降低，从而抑制了Z.rouxii的生长，菌落总数降低。继续增加L.plantarum的添加比例后，L.plantarum成为优势菌群，开始快速生长繁殖，菌落总数增加。最终确定Z.rouxii和L.plantarum的最优复配比例为1∶1。

2.3 以pH值为响应值的响应面试验结果

2.3.1 响应面回归模型的建立与分析

基于单因素试验结果，以培养温度(A)、培养时间(B)和复配比例(C)为变量，根据Box-Behnken试验原理，以发酵液pH值为响应值，进行二次多项回归方程拟合及分析。试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

续 表

对试验数据进行多项式拟合回归，得二次多元回归方程：Y1=7.09-0.11A-0.064B+0.029C-0.038AB+0.028AC-0.17BC+0.048A2-0.08B2-0.11C2。

对模型进行方差分析和显著性检验，分析回归方程的拟合度，结果见表3。

表3 回归方程方差分析表

模型的P<0.0001，说明拟合所得二次多元回归方程达到了极显著水平，并且方程的拟合程度较好，失拟项P>0.05，不显著，可以准确地分析和预测培养温度、培养时间和复配比例等因素与发酵液pH值间的关系。模型R2=0.9905，说明该模型拟合程度较好，可以利用该模型分析和预测Z.rouxii和L.plantarum的复配条件。所得二次多元回归方程一次项A，B，交互项BC和二次项C2对发酵液pH值的影响极显著，一次项C，交互项AB、AC，二次项A2、B2对发酵液pH值的影响显著。由F值可知各因素对发酵液pH值影响的大小顺序为：培养温度(A)>培养时间(B)>复配比例(C)。

2.3.2 响应面分析与优化

根据回归模型，对培养温度(A)、培养时间(B)和复配比例(C)3个因素两两对发酵液pH值作响应面图和等高线图，见图5。

图5 不同因素交互作用对发酵液pH值的影响

由图5可知，不同因素间交互作用对发酵液pH值的影响可以通过响应面的变化及等高线的密集程度直观地反映出来，当响应面图呈马鞍或椭圆形时，说明两因素的交互作用对响应值影响显著[14,15]。培养温度、培养时间和复配比例3个因素两两对发酵液pH值影响所得响应面图均为马鞍形，说明3个因素两两交互作用显著。根据等高线的密集程度，培养温度对发酵液pH值影响的等高线较密集，说明培养温度的影响更为显著，与回归方程方差分析结果基本一致。

2.4 以菌落总数为响应值的响应面试验结果

2.4.1 响应面回归模型的建立与分析

基于单因素试验结果，以培养温度(A)、培养时间(B)和复配比例(C)为变量，根据Box-Behnken试验原理，以发酵液菌落总数为响应值，进行二次多项回归方程拟合及分析。试验设计及结果见表4。

表4 响应面试验设计及结果

续 表

对试验数据进行多项式拟合回归，得二次多元回归方程：Y2=11.37-0.068A-0.013B-0.014C-0.019AB-0.028AC-0.084BC-0.048A2-0.047B2-0.066C2。

对模型进行方差分析和显著性检验，分析回归方程的拟合度，结果见表5。

表5 回归方程方差分析表

模型的P<0.0001，说明拟合所得二次多元回归方程达到了极显著水平，并且方程的拟合程度较好，失拟项P>0.05，不显著，可以准确地分析和预测培养温度、培养时间和复配比例等因素与发酵液菌落总数间的关系。模型R2=0.9865，说明该模型拟合程度较好，可以利用该模型分析和预测Z.rouxii和L.plantarum的复配条件。所得二次多元回归方程一次项A，交互项BC和二次项C2对发酵液菌落总数的影响极显著，一次项B，C，交互项AB、AC，二次项A2、B2对发酵液菌落总数的影响显著。由F值可知各因素对发酵液菌落总数影响的大小顺序为：培养温度(A)>复配比例(C)>培养时间(B)。

2.4.2 响应面回归模型的建立与分析

根据回归模型，对培养温度(A)、培养时间(B)和复配比例(C)3个因素两两对发酵液菌落总数作响应面图和等高线图，见图6。

图6 不同因素交互作用对发酵液菌落总数的影响

由图6可知，不同因素间交互作用对发酵液菌落总数的影响可以通过响应面的变化及等高线的密集程度直观地反映出来。培养温度与培养时间、培养温度与复配比例的响应面图为马鞍形，培养时间与复配比例的响应面图接近椭圆形，说明3个因素两两交互作用显著。

2.5 回归模型的验证结果

本研究选取发酵液pH值和菌落总数作为响应值优化Z.rouxii和L.plantarum的复配条件，响应面分析结果也表明培养时间、培养温度和复配比例均对发酵液pH值和菌落总数具有显著影响，可以通过pH值和菌落总数的变化判断Z.rouxii和L.plantarum间的生长情况。但在实际培养过程中不能仅以pH值作为Z.rouxii和L.plantarum生长情况的判断依据，必须与菌落总数指标综合考虑。因此，回归模型的验证选取菌落总数作为最优复配条件的判断依据，最优复配条件为培养温度20.71 ℃，培养时间22.99 h，Z.rouxii和L.plantarum的复配比值为1.32，此时模型预测发酵液的菌落总数为11.39 lg CFU/mL。对优化结果进行验证，实际结果为10.72 lg CFU/mL，与预测值拟合度达94.12%，表明模型拟合度较好，可以用于优化Z.rouxii和L.plantarum的复配条件。

3 结论

本试验以培养温度、培养时间和复配比例为变量，以pH值及菌落总数为响应值，进行响应面试验和方差分析，结果显示:两组试验的预测模型均极显著(P<0.01)，培养温度、培养时间和复配比例间两两交互作用均显著，对发酵液pH值影响因素排序为培养温度>培养时间>复配比例，对发酵液菌落总数影响的大小顺序为：培养温度>复配比例>培养时间。以菌落总数优化复配条件为培养温度20.71 ℃、培养时间22.99 h、Z.rouxii和L.plantarum的复配比值为1.32。对优化结果进行验证，实际结果与预测值拟合度达94.12%。