嗜酸乳杆菌发酵猪肉干货架期延长的条件优选

陈菲菲，赵长青，王世超，冯娇

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000)

鉴于当代人越来越强的保健意识，发酵类食品因其丰富的营养价值而受到关注。发酵肉制品中富含的有益微生物可产生乳酸、乳酸菌素等代谢产物，降低了肉制品的pH，对致病菌和腐败菌形成竞争性抑制作用[1]；在发酵的同时还会降低肉品水分含量，这些能够提高肉制品安全性并延长其货架期。猪肉作为最通用的食材，其蛋白质含量高，而脂肪、胆固醇含量相对较低，味道鲜美而且营养价值丰富[2]，因而将猪肉进行发酵制成休闲食品是一大趋势。比如将猪肉制成发酵香肠已有许多研究[3-6]，而火腿也是猪肉比较常见的一种加工方式，现也有相关报道[7-9]，对火腿中菌群进行了分析和筛选，现在比较受欢迎的猪肉脯也可见相关研究[10]。在西方国家如美国、德国、意大利等已经有较成熟的发酵肉制品的人工发酵生产技术并且已经实现了工业化生产[11]，研究发现摄入乳酸杆菌和含活性乳酸菌的食品会使乳酸菌定植到人的大肠内，继续发挥作用，从而形成抑制有害菌增殖的环境，有利于协调人体肠道内微生物菌群的平衡[12]。

传统工艺生产的猪肉干多会添加发色剂硝酸盐、亚硝酸盐和防腐剂等，虽然市场上产品按照国家标准进行添加，摄入量较小，但毕竟存在安全隐患[13]。而发酵猪肉干因具有特有的风味、便捷、营养、不添加任何防腐剂、开发潜力巨大等优势，逐渐受到越来越多消费者的青睐和欢迎。如今利用乳酸菌作为功能性发酵剂，将猪肉发酵制成发酵猪肉干的尝试也逐渐成为一种新的休闲肉制品加工方法。目前研究延长发酵肉制品的货架期方面已有报道[14,15]。本实验在前期对发酵猪肉干风味等方面已经进行过相关研究[16]，为了将发酵猪肉干向工业生产方向发展，还需要对发酵猪肉干的货架期进行进一步研究。

本实验通过探索不同的发酵条件(接种量、发酵温度、发酵时间)和烘烤条件(烘烤温度、烘烤时间)，研究如何延长嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的货架期，以微生物指标为标准，确定出货架期最长的发酵猪肉干工艺条件，为发酵肉制品的生产和微生物控制提供了参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

新鲜猪肉、白砂糖、盐、菜籽油、酱油、姜、高温蒸煮袋:市售；葡萄糖、乳糖：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 菌株

实验用嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)为本实验室储藏，使用前在乳酸菌培养基上活化24 h。

1.1.3 仪器与设备

HH-6D数显恒温水浴锅、SHP-80生化培养箱 常州普天仪器制造有限公司；JA5003电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰空气技术有限公司；V1000型可见分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司；DHG-9140B电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司；PHS-3C数字酸度计 成都方舟科技开发有限公司；SKY-2102C恒温振荡培养箱 上海苏坤实业有限公司；DZQ4/2E真空包装机 温州奔腾机械有限公司。

1.2 实验

1.2.1 发酵猪肉干加工工艺流程

发酵液的制备→原料肉预处理→初煮→复煮→灭菌→接种→发酵→烘烤→包装→灭菌→储藏。

1.2.2 单因素实验

通过对发酵条件和烘烤条件进行优化，目的是探索出货架期较长的发酵猪肉干的工艺条件。本实验以前期研究得到的感官指标较好的发酵猪肉干作为对照组，其工艺条件为：接种量5%、发酵时间36 h、发酵温度30 ℃、烘烤温度95 ℃、烘烤时间75 min。本实验中发酵条件(接种量、发酵温度、发酵时间)和烘烤条件(烘烤时间、烘烤温度)的优化步骤如下。

1.2.2.1 接种量的优化

在发酵时间36 h、发酵温度30 ℃、烘烤温度95 ℃、烘烤时间75 min的情况下，分别取接种量1%、2.5%、5%、7.5%、10%(V/V)，以考察接种量对发酵猪肉干货架期的影响。

1.2.2.2 发酵温度的优化

在接种量5%、发酵时间36 h、烘烤温度95 ℃、烘烤时间75 min的情况下，分别取发酵温度20，25，30，35，40 ℃，以考察发酵温度对发酵猪肉干货架期的影响。

1.2.2.3 发酵时间的优化

在接种量5%、发酵温度30 ℃、烘烤温度95 ℃、烘烤时间75 min的情况下，分别取发酵时间12，24，36，48，60 h，以考察发酵时间对发酵猪肉干货架期的影响。

1.2.2.4 烘烤时间的优化

在接种量5%、发酵温度30 ℃、发酵时间36 h、烘烤温度95 ℃的情况下，分别取烘烤时间为70，75，80，85 min，以考察烘烤时间对发酵猪肉干货架期的影响。

1.2.2.5 烘烤温度的优化

a.不同温度下含水率小于且最接近20%的烘烤时间的测定

按照国家标准，肉干类制品含水率不得超过20%[17]。为了既能达到国家要求，又能使猪肉干具有较好口感，实验需首先测得不同温度(75，85，95，105 ℃)下发酵猪肉干含水率小于且最接近20%的烘烤时间。

b.最优烘烤温度的确定

在接种量5%、发酵温度30 ℃、发酵时间36 h的情况下，改变烘烤温度(各烘烤温度下对应的烘烤时间为猪肉干含水率小于且最接近20%的烘烤时间)，取值分别为75，85，95，105 ℃，以考察烘烤温度对发酵猪肉干货架期的影响。

1.2.3 发酵猪肉干微生物指标检测

按照肉干的国家标准，通过检测嗜酸乳杆菌发酵猪肉干中微生物指标(包括菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌)来确定其货架期，检测标准见表1。即：本次实验对发酵猪肉干的微生物检测采取三级采样方案，按照三级采样方案设定的指标，在同一批发酵猪肉干的5个样品中，允许全部样品中菌落总数≤104CFU/g、大肠杆菌数≤10 CFU/g；允许有≤2个样品的菌落总数在104～105CFU/g之间、大肠杆菌数在10～102CFU/g之间，不允许有样品的菌落总数>105CFU/g、大肠杆菌数>102CFU/g；任何一个样品不得检出致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌)[18]。

其中，菌落总数的检测参照GB 4789.2-2016操作；大肠菌群的检测参照GB 4789.3-2016操作；沙门氏菌的检测参照GB 4789.4-2016操作；金黄色葡萄球菌的检测参照GB 4789.10-2016操作；志贺氏菌的检测参照GB 4789.5-2012操作。

表1 发酵猪肉干微生物指标[19]

2 结果与分析

2.1 不同发酵条件对发酵猪肉干货架期的影响

2.1.1 接种量对发酵猪肉干货架期的影响

表2 不同接种量下猪肉干的微生物检测结果

由表2可知，当发酵猪肉干储藏温度为30 ℃时，未发酵的猪肉干在储藏3 d时长出了致病菌沙门氏菌,在储藏2 d时微生物指标符合国家标准，所以未发酵猪肉干的货架期为2 d；接种量为5%的未优化发酵猪肉干在储藏7 d时长出了致病菌金黄色葡萄球菌；接种量为2.5%和7.5%的发酵猪肉干在储藏7 d时长出了致病菌金黄色葡萄球菌；接种量为10%的猪肉干在储藏13 d时最高的微生物菌落总数为1.35×105CFU/g，超过了微生物上限值105CFU/g，而且长出了致病菌金黄色葡萄球菌，以上均不符合储藏要求，被淘汰。接种量为1%的发酵猪肉干在储藏16 d时长出了金黄色葡萄球菌，在储藏13 d时微生物指标符合国家标准，所以未发酵猪肉干的货架期为13 d，是接种量优化实验中货架期最长的。因此，可以确定1%为嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的最优接种量。相比较未发酵的猪肉干(2 d)，其货架期延长了11 d，主要是因为在此接种量下可以促进嗜酸乳杆菌新陈代谢，将糖类或糖类物质分解产生有机酸、乙醇等物质，进而抑制有害微生物(脂解菌和朊解菌等)的生长繁殖活动[20]，从而使有害菌的生长不能大量进行，所以延长了发酵猪肉干的储藏时间。

2.1.2 发酵时间对发酵猪肉干货架期的影响

表3 不同发酵时间下猪肉干的微生物检测结果

由表3可知，发酵时间为12，24，36 h的发酵猪肉干在7 d时都长出了致病菌金黄色葡萄球菌，按照国家标准这些样品被淘汰。储藏到第10天时，发酵时间为48 h的发酵猪肉干长了致病菌沙门氏菌，说明该样品已经过期；储藏到第13天时，发酵时间为60 h的猪肉干长了致病菌金黄色葡萄球菌，被淘汰，说明其货架期为10 d，较未发酵猪肉干货架期(2 d)延长了8 d，是发酵时间优化实验中货架期最长的。因此，确定60 h为嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的最优发酵时间，主要原因可能是在猪肉进行发酵的过程中，随着发酵时间的延长，嗜酸乳杆菌跨过生长和繁殖阶段，进行同型乳酸发酵，同时产生谷氨酸和甘氨酸等风味物质，发酵过程中酸类物质积累，腐败菌生理活动得到基本抑制，所以其货架期有所延长。

2.1.3 发酵温度对发酵猪肉干货架期的影响

表4 不同发酵温度下猪肉干的微生物检测结果

由表4可知，将发酵猪肉干储藏7 d后，发酵温度为20，25，30 ℃的发酵猪肉干都检测出了致病菌金黄色葡萄球菌，因此被淘汰。发酵温度为35 ℃的发酵猪肉干在储藏7 d时大肠菌群为3.1×103CFU/g，超过了大肠杆菌上限值102CFU/g，超标，被淘汰。发酵温度为40 ℃的发酵猪肉干在储藏10 d时，有3个样品菌落总数在104～105CFU/g之间，说明在该发酵时间下的猪肉干货架期为7 d，是发酵温度优化实验中货架期最长的。因此，确定40 ℃为嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的最优发酵温度。相比于未发酵的猪肉干(2 d)，货架期延长了5 d，原因可能是在此发酵温度下，促进了嗜酸乳杆菌对营养物质的吸收，提高了微生物体内酶促反应的速度[21]，蛋白质和脂肪等在组织蛋白酶和脂肪酶的作用下分解为各种有机酸(游离氨基酸和乳酸等)，使整个发酵猪肉干呈现酸性环境，腐败细菌得到基本抑制，所以发酵猪肉干的货架期有所延长。

2.1.4 烘烤时间对发酵猪肉干货架期的影响

表5 不同烘烤时间下猪肉干的微生物检测结果

由表5可知，储藏到第7天时，烘烤时间为70 min和75 min的发酵猪肉干都检测出了致病菌金黄色葡萄球菌；烘烤时间为85 min的发酵猪肉干在储藏7 d时微生物菌落总数最高，为1.76×105CFU/g，超过了菌落总数上限值105CFU/g，以上均不符合国家标准，被淘汰。烘烤时间为80 min的发酵猪肉干在储藏13 d时微生物菌落总数最高，为1.25×105CFU/g，超过了菌落总数上限值105CFU/g，而且长出了致病菌金黄色葡萄球菌，说明该烘烤时间下的猪肉干货架期为10 d，是烘烤时间优化实验中货架期最长的。因此，确定80 min(烘烤温度为95 ℃)为嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的最优烘烤时间，相比于未发酵的猪肉干(2 d)，货架期延长了8 d。烘烤时间为80 min的猪肉干货架期有所延长，原因可能是随着烘烤时间的延长，肉干的水分活度(Aw)有所下降，当Aw低于0.9时，细菌几乎不能生长，Aw的减少降低了微生物生长速率，延长了微生物对数生长期，此外还对微生物的代谢活动产生负作用，引起了代谢途径和细胞成分的变化[22]，所以延长了发酵猪肉干的货架期。

2.2 烘烤温度对各指标的影响

2.2.1 含水率的测定

为了对嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的烘烤温度进行优化，需要找到不同烘烤温度下含水率小于且最接近20%(按照国家标准，肉干含水率不超过20%)的烘烤时间，这样既能达到国家要求，又能使猪肉干具有较好口感，不同烘烤条件的发酵猪肉干含水率见图1。

图1 不同烘烤条件下发酵猪肉干的含水率

由图1可知，当烘烤温度为75 ℃时，含水率小于且最接近20%(按照国家标准，肉干含水率不超过20%)的烘烤时间为125 min，此时含水率为18.86%。当烘烤温度为85 ℃时，含水率小于且最接近20%的烘烤时间为100 min，此时含水率为19.35%。当烘烤温度为95 ℃时，含水率小于且最接近20%的烘烤时间为75 min，此时含水率为18.20%。当烘烤温度为105 ℃时，含水率小于且最接近20%的烘烤时间为65 min，此时含水率为19.78%。

2.2.2 烘烤温度对发酵猪肉干货架期的影响

表6 不同烘烤温度下猪肉干的微生物检测结果

由表6可知，储藏7 d时，烘烤温度为75，95 ℃的发酵猪肉干都长出了致病菌金黄色葡萄球菌；烘烤温度为85 ℃的发酵猪肉干在储藏10 d时5个样品的菌落总数在104～105CFU/g之间，以上均不符合国家标准，被淘汰。烘烤温度为105 ℃的发酵猪肉干在储藏13 d时微生物菌落总数最高，为2.53×105CFU/g，超过了菌落总数上限值105CFU/g，说明该烘烤温度下的猪肉干货架期为10 d，是烘烤温度优化实验中货架期最长的。因此，确定105 ℃(烘烤时间为65 min)为嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的最优烘烤温度。相较于未发酵的猪肉干(2 d)，发酵猪肉干货架期延长了8 d，主要原因是该烘烤温度下制成的发酵猪肉干的水分含量低，游离水较少，抑制了部分微生物(包括细菌和霉菌等)的生长，减少了肌肉组织的腐坏和脂肪的氧化与酸败[23]，因此嗜酸乳杆菌发酵猪肉干的货架期得到延长。

由表5、图1和表6可知，经过单因素实验优化后，烘烤温度为95 ℃、烘烤时间为80 min的发酵猪肉干货架期与烘烤温度为105 ℃、烘烤时间为65 min的发酵猪肉干货架期一致，但综合含水率来看，烘烤温度为105 ℃、烘烤时间为65 min的发酵猪肉干口感更好，所以此工艺条件更优。

整个实验在30 ℃储藏下进行，此温度下大部分微生物生长迅速，食品的保质期受温度的影响较大，温度的升高或降低都会引起化学反应速率变化。本实验相当于加速了发酵猪肉干腐败的进程，而一般的肉干的贮藏温度为20 ℃左右，相当于贮藏温度提高了10 ℃，类似于进行了一次破坏性实验，所以嗜酸乳杆菌发酵猪肉干在室温下的货架期将会更长。

3 结论

本实验在不同的接种量、发酵温度、发酵时间、烘烤温度、烘烤时间条件下，用嗜酸乳杆菌对猪肉发酵制成猪肉干，以发酵猪肉干微生物指标为检测对象，确定出嗜酸乳杆菌发酵猪肉干储藏时间最长的工艺条件为：接种量1%、发酵时间60 h、发酵温度40 ℃、烘烤时间65 min、烘烤温度105 ℃。整个实验进程中，发酵猪肉干并未添加任何防腐剂，不仅保障了发酵猪肉干的营养价值和安全性，一定程度上也为厂家出品新产品提供了广阔的市场前景和生产依据。