血府逐瘀汤影响退变椎间盘髓核组织内蛋白水解酶和微血管生成的机制

郭义 林俊

(萍乡市中医院骨科，江西 萍乡 337000)

椎间盘退变增加了腰痛的风险，并在社会中造成严重的经济和健康负担〔1〕。成人椎间盘主要由三部分组成，包括内髓核，外环状纤维和终板〔2〕。椎间盘是无血管的，这使得损伤后完全修复。椎间盘退变有很多原因，其中炎症起着重要作用〔3〕。白细胞介素(IL)-1β具有有效的促炎作用，可刺激促炎因子的释放〔4〕。已经证明它在椎间盘退变期间导致炎症，基质降解，氧化应激反应和细胞凋亡〔5〕。因此，由于在椎间盘退变早期阶段的炎症作用，抗炎治疗是优先考虑的因素。据报道，血府逐瘀汤是治疗椎间盘退变疾病的一种古老的中药配方，由11种粗草药组成：桃李、当归、川芎、红花、芍药、地黄、枳壳、柴胡、桔梗、牛膝和甘草〔6〕。血府逐瘀汤衍生的化合物，包括羟基红花黄色素A和苦杏仁苷，已被证明具有控制炎症反应的能力〔7〕。血府逐瘀汤具有血管生成作用，不仅可以增加鸡胚绒毛尿囊膜模型中的血管数量，还可以动员骨髓内皮祖细胞(EPC)，促进EPC分化和血管形成〔8，9〕。在炎症相关的结肠癌发生受到血府逐瘀汤的抑制，表明它可以作为治疗结肠炎相关结肠癌的强有力的预防剂〔10〕。另外，已经在兔关节软骨细胞中证明了血府逐瘀汤抑制基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13的表达〔11～13〕。血府逐瘀汤对IL-1β诱导的髓核的影响尚未进行过研究，因此，本研究旨在探讨血府逐瘀汤影响退变椎间盘髓核组织内蛋白水解酶和微血管生成的机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 体重200～250 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由实验动物研究中心提供。将它们在标准条件下维持至少1 w，然后禁食12 h，在每次实验前自由获取食物和水。

1.2椎间盘退变模型 根据体重，用1%戊巴比妥钠(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以0.4 ml/kg麻醉SD大鼠。对于椎间盘退变模型，Co7/Co8或Co8/Co9尾椎椎间盘之间的椎间盘间隙首先通过放射线照相定位。将由手工制作的塞子控制的20号无菌针插入距离背侧至腹侧约5 mm处，旋转360°并保持在固定位置30 s，然后移除。

1.3医学伦理学问题 所有外科手术干预、治疗和术后动物护理程序均严格按照机构动物护理和使用委员会的规定进行，并符合实验动物护理和使用指南。

1.4实验分组 将72只雄性大鼠分为对照组(无针刺或治疗)；椎间盘退变组(仅针刺)；血府逐瘀汤组(每周注射含50 μmol/L血府逐瘀汤的PBS进行针刺)各24只。由于椎间盘的无血管性质，使用31-G针的微量注射器进行注射。这里使用的体内剂量是基于体外实验，其中我们确定了血府逐瘀汤的无毒性和有效性。

1.5实验方法

1.5.1大鼠髓核细胞的分离、培养和治疗 将髓核细胞维持在DMEM/F12(Gibco公司，纽约)和补充有抗生素的10%磷酸盐缓冲液(PBS)中。使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)将细胞以80%～90%的传导率传代。在以下所有实验中，我们对细胞使用了2～3次传代。将细胞在37℃培养箱中于5%CO2下培养。培养基每2 d更换一次。对于细胞活力检测，使用不同浓度的血府逐瘀汤处理髓核细胞 24 h。为了检测炎症的指标，用血府逐瘀汤预处理细胞2 h，然后用或不用IL-1β处理24 h。

1.5.2血府逐瘀汤制剂 血府逐瘀汤由以下成分组成：当归9 g、地黄9 g、桃李12 g、红花9 g、枳壳6 g、芍药6 g、柴胡3 g、甘草6 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g和牛膝9 g。原料购自医院药房。每种药草均由大学中草药系的草药植物学家认证。根据标准方法，使用具有上述比例的11种血府逐瘀汤草药生成血府逐瘀汤的冻干粉末。最后，确定1 g冻干粉末含有5.2 g粗草药。根据1 g/ml(W/V)的标准，将其在用蒸馏水分解之前储存在4℃下使用。

1.5.3总RNA分离和实时PCR 使用RNAiso试剂提取总RNA。使用2 μg RNA和PrimeScriptTMRT Master Mix进行逆转录。使用SYBR®检测cDNA，在StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司，美国)上的Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒。使用2-ΔΔCt方法分析数据。使用的引物序列为MMP-1，上游GCGTATATGGGCTAGAAGCAT、下游GCGTATATACGTTTTAGAGCC；MMP-3，上游TAGCTATGCGTAAATTTCGCT、下游AAATTGCGCGTAGCGCGGCA；MMP-9，上游CATTTAGCTAGAGCTTTGCCG、下游GCTAGATCGCTAGCTAGCTAG；β-actin，上游GTATAAATTCTATGCGCGATA、AAAACGCGCTAGC TCGCCGT。

1.5.4酶联免疫吸附试验(ELISA) 在9体积(1∶9，W/V)冰冷的生理盐水中裂解髓核细胞。将匀浆物离心15 min(3 000 r/min，4℃)。根据制造商的说明书(武汉华美生物工程有限公司，中国)，将上清液用于测量MMP-1、MMP-3和MMP-9的含量。使用Bradford方法测量组织蛋白质浓度。

1.5.5蛋白质免疫印迹 通过蛋白质免疫印迹检测微血管生成相关因子〔血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子(TGF-β)〕蛋白表达。在蛋白质裂解缓冲液(碧云天生物技术研究所，上海)中裂解髓核细胞。通过二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海)测试蛋白质浓度，并将蛋白质样品与5倍加载缓冲液混合。通过10%或12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质，并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(密理博公司，上海)。在5%脱脂牛奶中封闭2 h后，用TBST中的一抗在4℃下探测印迹过夜。将印迹与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(抗兔或抗小鼠；碧云天生物技术研究所，上海)一起温育。然后使用增强的化学发光(密理博公司，上海)显色印迹，并使用Bio-Rad XRS化学发光检测系统(伯乐生命医学产品有限公司，上海)成像。使用Image J软件定量条带密度。相对于GAPDH的水平呈现蛋白质表达量。

1.5.6细胞活力测定 根据方案使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8；东仁化学科技有限公司，上海)评估细胞活力。将大鼠髓核细胞以2 000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在血府逐瘀汤处理24 h后，除去每个孔中的培养基并用含有10% CCK-8溶液的200 μl新鲜培养基替换，并将细胞在37℃再培养2 h。收集100 μl样品，并使用酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司，上海)在450 nm处在96孔板中测量活力。

1.5.7磁共振成像(MRI) 在大鼠尾椎针刺模型中在椎间盘之间每周注射一次血府逐瘀汤。在注射后通过MRI评估骶椎椎间盘。简而言之，将大鼠麻醉并置于3.0T MRI扫描仪(Signa Excite，Little Chalfont公司，美国)中的俯卧位。T2加权切片在矢状平面中成像。数据由3名独立的盲法观察员处理。

1.6统计分析 采用SPSS11.0软件进行方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1蛋白水解酶相关基因mRNA的表达水平 与对照组比较，椎间盘退变组MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表达水平明显增加，而血府逐瘀汤组较椎间盘退变组MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表达水平明显降低(均P<0.05)。见表1。

表1 各组蛋白水解酶相关基因mRNA表达

2.2蛋白水解酶相关基因蛋白含量检测 与对照组相比，椎间盘退变组MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明显增加，而血府逐瘀汤组较椎间盘退变组MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组蛋白水解酶相关基因蛋白含量

2.3Western印迹检测微血管生成相关因子蛋白表达 与对照组相比，椎间盘退变组VEGF、FGF和TGF蛋白表达水平明显降低，而血府逐瘀汤组较椎间盘退变组VEGF、FGF和TGF蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。见表3、图1。

2.4CCK-8检测细胞活力 与对照组〔(98.23±8.72)%〕相比，椎间盘退变组细胞存活率〔(55.44±5.26)%〕明显降低，而血府逐瘀汤组〔(82.74±7.95)%〕较椎间盘退变组细胞存活率明显增加，3组比较差异有统计学意义(F=12.148，P=0.003)。

表3 各组微血管生成相关因子蛋白表达水平比较

图1 Western印迹检测微血管生成相关因子蛋白

2.5炎症相关因子mRNA表达水平 与对照组相比，椎间盘退变组TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表达水平明显增加，而血府逐瘀汤组较椎间盘退变组TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表达

2.6血府逐瘀汤减缓了大鼠尾椎椎体针刺模型中椎间盘退变的进展 MRI结果表明，与对照组相比，椎间盘退变组MRI信号强度降低。然而，与椎间盘退变组相比，血府逐瘀汤组显示出更高的MRI信号强度。见图2。

图2 各组MRI评估骶椎椎间盘

3 讨 论

椎间盘退变是一种流行的疾病，在衰老过程中自然发生。其特征在于局部髓核区域中细胞外基质的逐渐丧失，是成人背部疼痛的最常见原因，具有巨大的社会经济意义〔14，15〕。金属蛋白酶和促炎细胞因子在该过程中起重要作用〔16〕。因此，抗炎策略是椎间盘退变治疗的重要组成部分。血府逐瘀汤因其有效的抗炎作用而广为人知〔17〕。IL-1β被认为是一种重要的细胞因子，它通过刺激一系列不同介质(如趋化因子，细胞因子和MMPs)的产生而发挥有效的促炎作用〔18，19〕。已经充分描述了IL-1β在由退行性椎间盘影响的细胞中升高，这种作用与椎间盘体内平衡的功能失调密切相关并导致髓核组织的降解〔20〕。因此，本实验中使用IL-1β作为促炎剂。

本研究结果表明，血府逐瘀汤抑制IL-1β诱导的炎症介质(TNF-α、IL-6和IL-10)和基质降解蛋白酶(MMP-1，MMP-3和MMP-9)。此外，本研究发现血府逐瘀汤通过调节VEGF、FGF和TGF蛋白表达，增加微血管生成。体内MRI和组织学结果还显示，血府逐瘀汤保护髓核免受椎间盘退变的进展。因此，血府逐瘀汤可能是治疗椎间盘退变的潜在药物。

除了体外研究，本研究使用大鼠尾椎针刺模型来评估血府逐瘀汤是否可以在体内保护髓核。证据表明，在椎间盘退变的发展中，炎症加剧了软骨的退化。本研究结果表明血府逐瘀汤治疗可以减缓椎间盘退变的进展。