胃肠道间质瘤胰岛素样生长因子1受体表达水平与伊马替尼耐药的相关性

王炯元， 童汉兴， 姜 铨， 侯英勇， 陆维祺*

1. 复旦大学附属中山医院普通外科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于Caja细胞，是消化系统最常见的间叶源性肿瘤，占胃肠道肿瘤总数的1%～4%，每年发病率约为2/10万[1-2]。GIST可发生在消化系统的任何部位，其中以胃(60%)和小肠(30%)最常见[3-4]。肝转移和腹腔播散是GIST临床上最常见的恶性表现，淋巴结转移少见。c-Kit基因及血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRα)基因的功能获得性突变是GIST发病的主要机制[5]。75%～80%GIST存在c-Kit基因突变，5%～10%GIST伴PDGFRα基因突变[6]，10%～15%GIST既无PDGFRα基因突变也无c-Kit基因突变，被称为野生型GIST。一部分野生型GIST患者伴SDH基因改变，被称为SDH缺陷型，也有极少数病例存在NF-1、BRAF等其他基因的罕见突变[7]。

甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate，IM)是一种选择性酪氨酸激酶抑制剂，自2002年获得美国FDA批准以来，已成功应用于治疗转移性和(或)无法切除的GIST患者，同时也用于高危复发风险患者的术后辅助治疗。随着药物的临床应用，其耐药问题也日益彰显，10%～15%患者存在原发耐药，40%～50%患者在2年内出现继发性耐药[8]。SDH缺陷型GIST患者多表现为原发耐药。继发性耐药的可能机制则包括c-Kit和PDGFRα基因的二次突变、基因扩增、下游信号通路的异常活化、IM血药浓度及细胞内药物浓度的改变等[9]。IM耐药机制尚未被完全阐明，可能是多个机制共同作用的结果。因此，IM耐药是目前GIST临床治疗的难点，也是当下临床研究的热点。

胰岛素样生长因子家族(insulin-like growth factors，IGFs)由胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2， IGF-2)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)、胰岛素受体(insulin receptor，IR)及6个胰岛素生长因子结合蛋白(IGF-binding proteins，IGFBPs)组成[10]。IGFs在细胞分化、增殖及个体的生长发育中具有重要的促进作用[11-12]，也与肿瘤形成及发展密切相关。Tarn等[13]报道，野生型GIST中IGF1R的表达高于c-Kit/PDGFRα突变型标本，提示IGF1R可能是原发性耐药患者的潜在治疗靶点。因此，本研究回顾性分析复旦大学附属中山医院收治的134例GIST组织IGF1R的表达水平与IM耐药的关系，探讨IGF1R对IM耐药GIST患者预后的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2008年1月至2014年1月复旦大学附属中山医院普通外科收治的经病理确诊的GIST患者的临床及病理资料。将所有病例术后组织石蜡切片制作组织芯片用于免疫组化染色。患者出院后通过门诊及电话随访患者生存情况。本研究患者均知情同意且签署知情同意书。

1.2 免疫组化法检测组织芯片中IGFR蛋白的表达 IGFR检测采用免疫组织化学法。组织芯片使用二甲苯脱蜡，梯度乙醇溶液(无水、95%、75%)脱水，TBS冲洗。柠檬酸抗原修复液处理后加入3%双氧水阻断其内源性过氧化物酶。冲洗后用10%山羊血清孵育30 min。移去血清，滴加按1∶150稀释的兔抗人多克隆IGF1R抗体(Abcam公司，美国)4℃孵育。冲洗后滴加生物素标记二抗(EnVision抗兔IgG试剂盒，Dako公司，丹麦)，室温孵育30 min后移去二抗，滴加新鲜配制的DAB显色并使用苏木精对比染色。梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，封片剂封片后镜检。

1.3 免疫组化结果判读 以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分，组织切片中胞质染为淡黄色至棕褐色者为阳性细胞。染色强度以多数细胞呈现的染色特性(染色深浅需与背景着色相对比)计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比即光学显微镜下随机取5个高倍视野(×400)，每个视野中计数100个肿瘤细胞，取阳性细胞平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色结果为染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性()，9～12分为强阳性()。评分<5分为IGF1R低表达，≥5分为IGF1R高表达，以上结果由2位有经验的病理科医生完成。

1.4 统计学处理 采用SPSS 24.0分析数据。计数资料采用χ2检验，采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，生存分析的组间比较采用log-rank检验，采用Cox风险比例回归模型对IM耐药患者行预后危险因素分析。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 GIST患者不同临床病理特征下IGF1R蛋白表达差异 结果(表1)显示：GIST组织IGF1R蛋白表达水平在不同性别、年龄、肿瘤大小、原发部位、核分裂相、突变基因、NIH危险度分级组间表达差异无统计学意义；IM耐药患者GIST组织IGF1R蛋白的表达率(73.08%)高于非IM耐药患者(41.67%)，差异有统计学意义(χ2=8.286，P=0.004)，提示IGF1R高表达可能与GIST患者IM耐药相关。图1示GIST标本病理结果。

表1 不同IGF1R蛋白表达水平GIST患者临床病理特征的对比 n(%)

图1 GIST组织不同IGF1R蛋白表达水平的免疫组化及H-E染色

2.2 生存分析 中位随访64.5(1～96)个月，134例患者中9例患者失访，27例患者死亡。26例IM耐药患者中2例失访，12例死亡。26例IM耐药患者预后风险的单因素分析结果(表2，图2)显示：IGF1R的表达水平与总生存时间相关，IGF1R高表达患者总生存时间短于IGF1R低表达患者(35.3vs71.3个月，P=0.04)。多因素分析结果(表3)表明：肿瘤原发部位、IGF1R表达水平是影响IM耐药患者总生存时间的独立危险因素。

表2 IM耐药GIST患者预后的单因素分析

图2 不同IGF1R表达IM耐药GIST患者预后分析

表3 IM耐药GIST患者预后的多因素分析

3 讨 论

IGF1R是一种跨膜受体酪氨酸激酶，可结合其配体IGF-1和IGF-2而被激活，并通过活化下游信号通路，包括磷脂酰肌醇3激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K-Akt)信号通路及丝裂原活化蛋白激酶(MAKP)通路，发挥生物学效应。近年来，IGFs在GIST发生发展中的作用也引起了关注。Tarn等[13]报道相对于c-Kit/PDGFRα突变型GIST，野生型GIST中IGF1R的表达显著升高，而野生型GIST往往表现为原发性耐药。而IGF1R是否参与了胃肠道间质瘤IM耐药目前尚不清楚。

本研究中，在IM耐药患者GIST组织IGF1R蛋白表达显著高于非耐药患者，由此推测IGF1R可能参与IM耐药的产生。Codony-Servat等[14]研究发现，在转移性结直肠癌中细胞核IGF1R的高表达可能导致化疗及靶向药物耐药的产生。近年来多个针对IGF1R的靶向药物已陆续进入临床试验，现有证据表明目前抗IGF1R治疗最大的作用在于预防或逆转传统治疗耐药。并且相较于单独应用，抗IGF1R治疗联合化疗或靶向治疗能增加获益[15]。Chen等[16]在IM耐药细胞系(GIST430和GIST48)中使用linstinib(一种IR/IGF1R抑制剂)与IM联合治疗，分别导致IM GIST430和GIST48的生存力降低60%和80%；而在IM敏感的GIST882细胞系中联合治疗与IM单药的效果相当。因此，IGF1R可作为IM耐药病例的潜在治疗靶点。本研究中，针对26例IM耐药患者的生存分析提示，IGF1R高表达患者总生存时间显著缩短，推测在IM耐药患者中IGF1R可作为预后不良的标志。同时，多项临床试验发现，IGF1R高表达的患者能从抗IGF1R治疗中获益。Asmane等[17]发现在使用抗IGF1R治疗的肉瘤患者中，IGF1R的核定位增加与良好的生存预后显著相关，提示IGF1R的表达或可成为筛选患者及监测治疗反应的潜在生物学标志物。

综上所述，本研究发现，IM耐药患者GIST组织中IGF1R的表达显著增高，IGF1R高表达患者的总生存时间短于IGF1R低表达患者，提示IGF1R参与GIST IM耐药的同时，或可作为IM耐药患者的预后判断指标，并且可能是IM耐药患者的潜在治疗靶点。