基于可降解磁性生物支架的离体三维心肌补片构建及其生物学特性分析

丛 硕， 王文硕， 杨 慧， 魏 来， 王春生

复旦大学附属中山医院心外科，上海 200032

心肌梗死及其导致的心肌重构和心衰长期以来是全球排名第一的致死因素[1-2]。严重的心肌缺血会造成大面积心肌细胞坏死，由于心肌细胞再生能力十分低下，最终可演变为心力衰竭[3]。近年来，虽然干细胞技术被应用于心肌梗死的治疗[4-6]。然而直接注射干细胞，存活率低且无法与原有心肌有效整合，难以维持稳定的疗效[7-8]。运用组织工程技术将干细胞先在体外复合于组织工程支架中，从而有效提高植入后干细胞的存活率，促进其与既有心肌建立血供联系以形成有功能的整体，成为当下重要的开拓性研究方向之一。

作为组织工程基本构架的生物支架材料必须满足生物相容性、可降解性、合适的厚度与良好的支撑性能等条件。这种材料首先需要具有合适的孔径与良好的孔隙率，能够为细胞生长提供足够的空间，使附着生长的细胞能获得充足的氧与养分输送而提高存活率；同时需要有生物功能性亲水表面，促进细胞黏附、增殖、分化，刺激细胞外基质形成；还要具有较高的抗压强度，表现出与自然心脏组织良好的生物机械适应性[9]。

有研究[10]表明，壳聚糖作为一种碱性的天然多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、内在抗菌活性以及与生长因子结合的能力；而芦荟胶已被多项实验证明具有抑制凋亡、促进细胞增殖的作用[11]。二者结合，可作为一种较理想的支架材料植入体内。此外，临床试验[12]证实，围手术期补充铁元素可以减少因失血所致的术后贫血的发生，并可以增强心脏搏出量和肾滤过率[13-14]。而对于急性心肌梗死的患者，增加血液循环中铁元素含量可以明显缩小心肌梗死面积并延缓左室重构[15]。因此，本研究以磁性氧化铁纳米颗粒(iron oxide nanoparticles, IONP)、壳聚糖和芦荟胶为原料合成新型磁性生物支架，并在此基础上构建离体三维心肌组织补片，探索其生物学特性，期望能为心肌梗死的移植物替代治疗提供新的选择。

1 材料和方法

1.1 磁性生物支架的制备 将0.6 g冰醋酸溶于100 mL纯水中制得弱酸性溶剂；称取1 g壳聚糖和0.2 g芦荟提取物粉末，缓慢加入剧烈搅拌的溶剂中，至溶液呈半透明状。通过溶剂热法制得IONP[16]，并将其加入上述溶液中，形成质量分数约为0.1%的磁性氧化铁、1%的壳聚糖及0.2%的芦荟黑色混合溶液。将上述混合溶液以固定速率于液氮中快速定型后，-50℃冷冻干燥48 h，制得磁性生物支架。使用前，用60Co辐照灭菌(25 kGy)。

1.2 力学性能表征 采用动态热机械分析仪Q850测试多孔支架的拉伸强度。将制备的支架裁剪成5 mm×2 mm×30 mm的长方条，固定在测试台上。以100～250 N的拉力，将样品以1 mm/min速度沿轴线拉伸至断裂。将所获得数据制图，获得材料的弹性模量和弹性应变极限。

1.3 孔隙率测试 将支架置于体积为V0的无水乙醇中，放入真空箱中，抽真空，记复合材料与乙醇的总体积为V1。移出支架并记录剩下的无水乙醇体积为V2。支架的孔隙率(P)=(V0-V2)/(V1-V2)×100%。

1.4 体外降解实验 将灭菌处理后的含有不同浓度芦荟胶成分的多孔支架称质量，记为(Wi)。浸入5 mL 含有0.2 mg/mL胶原酶Ⅰ的PBS溶液，于不同时间取出支架，离心干燥称质量，记为 (Wf)。降解度(D)=[(Wi-Wf)/Wi]×100%

同时，用磁共振监测不同时间点的含0.1% IONP的多孔支架(氧化铁组)以及不含IONP的多孔支架(无氧化铁组)的降解过程，并记录影像。

1.5 支架细胞毒性测试 将上述多孔支架裁剪成5 mm×5 mm×2 mm大小，浸泡于3 mL含5%FBS的DMEM培养液中72 h，并收集浸出液。将等数量H9C2大鼠心肌细胞接种至RTCA计数培养板内，加入支架材料浸出液200 μL培养(支架组)。用同样置于37℃ 72 h的DMEM+5%FBS培养液培养的细胞作为对照。设定程序，实时监测细胞48 h，观察其贴壁密度以及增殖速率。将所得数据绘图，比较两组细胞毒性。

1.6 离体三维心肌补片的构建 选取经60Co灭菌后的多孔支架，裁剪成约5 mm×5 mm×2 mm大小(约1 g)，放置于底部直径60 mm的低吸附细胞培养皿中。按4×105个/cm3密度，将分化至第21天的人心肌细胞接种到多孔支架上，并用含5%FBS的DMEM培养液培养7 d后，进行其他实验。

1.7 三维补片形貌表征 将培养7 d的离体心肌补片置入2.5%戊二醛，4℃固定12 h；0.1 mmol/L PBS漂洗后，用1%锇酸固定液固定1 h；用30%～100%乙醇梯度脱水；临界点干燥、喷金后，扫描电镜观察并摄片。

1.8 收缩-舒张功能测试 将培养7 d的离体三维心肌补片置于两电极之间，设定电极放电参数为40 mV、5 ms、0.2 Hz。记录组织收缩-舒张影像，用ImageJ图像分析软件对影像进行分析，用Clampfit轨迹拟合软件分析收集的数据，得出收缩-舒张曲线。

1.9 定量PCR 采用定量PCR方法分析支架组心肌补片与对照组心肌组织心肌细胞特异性基因及凋亡相关基因表达。按照TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 美国)操作步骤提取补片及组织总RNA。使用ReverTra AceTM逆转录试剂盒(TOYOBA, 日本)逆转录后，用SYBR Green Realtime PCR Master MixTM试剂盒(TOYOBA, 日本)行定量PCR检测。设计肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)、B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide, BNP)、心房钠尿因子(atrial natriuretic factor, ANF)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)特异性引物，序列见表1。以各目的基因与GAPDH表达量比值为目的基因相对表达量。各实验重复3次。

表1 心肌细胞特异性基因及凋亡相关基因引物序列

2 结 果

2.1 磁性生物支架的表面特征及孔隙率 通过梯度冷冻干燥法制得的磁性生物支架材料表面结构见图1A，可见梯度冷冻干燥法使该材料表面具有有序且联通性好的微米级孔，平均直径为(78.5±1.0)μm，平均面积为(1.09±0.07)×104μm2。此外，从其局部放大图可见孔壁上均匀分布有四氧化三铁颗粒。通过乙醇替代法对用不同芦荟质量分数制得的支架进行孔隙率测试，发现所有多孔支架的孔隙率>92%，表明所获得多孔支架内部为联通孔洞结构；随着制备溶液中芦荟含量的增多，孔隙率存在升高趋势(图1B)，表明芦荟成分的加入，使水分子分布更加均匀，冻干后进一步增强了支架的孔隙。

2.2 磁性生物支架的力学特性 通过动态热机械分析仪测定不同质量分数芦荟制得的支架在干燥状态下的机械拉伸强度及弹性拉伸应变极限，结果(图1C～1D)显示：多孔支架的机械拉伸强度并未随芦荟含量变化而改变，均约0.3 mPa；但随着芦荟含量的增多，支架的弹性拉伸应变极限量减小(P<0.05)，表明芦荟成分的加入，影响了壳聚糖分子之间的氢键结构强度，使得支架弹性降低。

图1 磁性生物支架的物理表征

2.3 磁性生物支架的生物学特性 经胶原酶Ⅰ模拟的体外生物降解测试结果(图2A)显示：含有0.2%芦荟胶成分的磁性生物支架表现出更好的生物降解速率，第3天已降解超过80%，第7天达到(82.9±2.4)%；当芦荟胶成分≥0.4%时，降解速率过快，第2天就几乎完全降解，无法固定称质量，提示复合支架的成分及结构与生物细胞外基质相似，使支架易被降解。磁共振(T2加权TSE序列影像，图2B)显示：随着时间延长，氧化铁组多孔支架由低信号逐渐转变为均质的高信号；而无氧化铁组多孔支架一直为均质的高信号。

2.4 磁性生物支架的细胞毒性 以类型相似但增殖能力更强的大鼠心肌细胞(H9C2)代替人心肌细胞对支架材料的体外细胞毒性进行评估，结果(图2C～2D)显示：用支架的浸出液培养的H9C2细胞密度略高于对照组，倍增时间为(30.8±5.4)h，约为对照组的3/4，倍增速率优于对照组，表明多孔支架对心肌细胞无显著毒性作用，其析出成分反而能促进细胞增殖。

2.5 离体三维心肌补片的形貌特征及收缩-舒张功能 细胞与支架共培养7 d后，支架表面心肌细胞黏附稳固、伸展良好，而支架孔隙也几乎被迁移的心肌细胞填充；心肌细胞排列整齐，在细胞与细胞、细胞与支架之间已形成紧密的结构，局部放大图可见相邻细胞间形成的紧密连接(图3A)。在外加电场刺激下，三维心肌补片可产生有节律的收缩-舒张运动(图3B)，表明构建的三维心肌补片具有一定的生理功能。

2.6 离体三维心肌补片对心肌细胞成熟与细胞凋亡的作用 对培养7 d后的三维心肌补片(支架组)以及同时间培养的自然成簇的心肌细胞(对照组)进行比较，结果(3C)显示：支架组心肌补片中心肌结构特异性蛋白ANF的mRNA表达量是对照组的3.82倍(P=0.038 4)，心肌细胞成熟相关基因BNP和cTnT的mRNA表达水平分别为对照组的5.14倍(P<0.001)和3.24倍(P=0.003)，凋亡相关基因Bax/Bcl-2比例仅为对照组的0.44倍(P=0.012)。

图2 磁性生物支架的生物学特性及毒性

3 讨 论

成年人的心肌自我更新能力十分有限。心脏缺血性疾病发生后，缺血区域心肌细胞损伤或死亡，但周围的心肌细胞无法分裂增殖，导致患者心力衰竭以致死亡。目前，基于干细胞的替代修复方法正越来越受到人们重视，其中组织工程心肌已成为最有希望的治疗方案之一[17-18]。因此，构建具有功能的组织工程心肌补片成为实现该目标的研究重点。

生理条件状态下，心肌细胞在由细胞外基质及相邻细胞形成的三维立体微环境中生长，与周围细胞通过传递的化学、电以及物理机械等信号紧密联系。因此，重建具有生理功能心肌组织的关键是构建良好生物相容性的立体支架材料，为细胞提供多维空间，并同时促进心肌细胞成熟以及功能化[19]，这样在未来才可用于组织移植，改善心肌梗死患者心脏功能。

支架的核心要素是孔隙和三维结构。有研究[10]表明，50～100 μm的孔径最适合心肌细胞生长及存活，支架的孔径过大会影响内皮细胞的迁移，从而阻碍血管化进程；孔径过小则导致细胞没有足够的生长空间，同时会妨碍养料的运输。本研究中的多孔支架以壳聚糖为骨架结构，加入芦荟成分，其活性基团具有强烈亲水性，使水分子分布更加均一，进而使干燥后的支架孔径均一，避免孔径过大或过小[20]。此外，梯度冷冻使支架产生了有序的层状结构而表现出规则的三维结构，为心肌细胞生长提供足够的空间，并使心肌补片中的心肌细胞形成良好的偶联，进而为细胞迁移及细胞间物质交换提供便利条件，有利于提高附着心肌细胞的存活率，促进心肌细胞成熟，改善心肌补片的机械性能和力学强度[21]，提高体外培养的组织工程心肌补片的生理功能。

其次是生物相容性，由于壳聚糖本身就是一种天然的碱性多糖，结合芦荟成分，使该支架具有良好的生物降解速率。但芦荟成分也部分破坏了壳聚糖骨架间的氢键结构，在使其降解速率加快的同时，也削弱了壳聚糖结构的拉伸应变能力[22]。芦荟强烈亲水特性使支架更有利于心肌细胞黏附，同时其释放的微量因子具有促进心肌细胞新陈代谢、改善心肌收缩功能的作用。

随着临床研究者对生物安全性的考虑增加，植入支架的可视化及实时监测也受到更多关注。氧化铁材料已被10余年的临床应用证明在体内具有良好的安全性[23-24]。该类材料通过体内巨噬细胞的吞噬分解产生铁离子，并最终进入机体铁元素循环[25]。故本研究引入磁性四氧化三铁纳米颗粒，赋予该支架在磁场作用下特殊的响应性，使其降解过程可用磁共振影像进行追踪，结果表明，随着降解的进行，该支架内部的IONP不断被分解或转运流失，使其磁性强度发生变化，且与降解程度正相关。此外，有研究[26]表明，利用表面晶体生长的方法成功制备可降解复合氧化铁支架，承载骨髓间充质干细胞可以有效改善心肌梗死所致心脏泵血功能降低。因此，进一步研究将着重关注该组织工程心肌补片植入心肌梗死动物模型体内后的安全性和有效性。

综上所述，本研究应用梯度冷冻干燥技术，成功制备了IONP-壳聚糖-芦荟胶多孔支架，并以之构建得到具有收缩-舒张生理功能的离体三维心肌补片。经证实该磁性生物支架可有效促进心肌细胞增殖和功能成熟，克服了传统细胞疗法存在的细胞成活率低及不成熟等问题，为将其应用于以心肌梗死为代表的缺血性心脏病的治疗提供了基础。