活血消异方对子宫内膜异位症大鼠胎仔围产期发育毒性的初步研究

孙伟伟，常 欢.2，赵瑞华*

（1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.首都医科大学附属北京康复医院，北京 100069）

子宫内膜异位症（endometriosis,EM）是妇科的疑难病，好发于育龄期女性，所导致的盆腔局部黏连、疼痛以及不孕严重影响患者生活质量及身心健康。血瘀为子宫内膜异位症的病理实质，临床辨证时使用活血消癥药物较多。活血消异方是在传承首都国医名师李光荣教授治疗子宫内膜异位症学术思想基础上，由赵瑞华教授凝练而成的治疗子宫内膜异位症、抑制子宫内膜异位症复发的核心方药。为确保临床用药安全性，课题组在评价活血消异方是否具有生殖毒性方面进行了系列工作和初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 性成熟、健康未孕的 SD 雌性大鼠，体质量（200±20）g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证编号 SCXK（京）2012-0001。饲养条件：清洁级动物房，温度 （22±3）℃，相对湿度 50%～60%，人工照明，12 h 光照，12 h 黑暗，食用标准颗粒饲料，饮水自由。

1.2 试剂及药物 注射用青霉素钠（批号：F3092117，华北制药股份有限公司）、水合氯醛（批号：20140304，北京化工厂）、茜素红（批号：130-22-3，国药集团化学试剂有限责任公司）、氢氧化钾（批号：10017092，国药集团化学试剂有限责任公司）。活血消异方由柴胡、制香附、丹参、赤芍、莪术、皂刺等药物组成，由中国中医科学院广安门医院制剂室提供。以上药物加 10 倍水，煎煮 3 次，每次 1 h，合并煎液，过滤，放置 24 h 后浓缩。中药低剂量组药物浓度为 每毫升1.8 g 生药，中药高剂量组药物浓度为 每毫升3.6 g生药，药液在 4 ℃冰箱保存。

1.3 造模与分组 造模前，连续1 周每日定时做阴道涂片检查，动情周期为4～5 日，选择动情周期正常的SD 雌性大鼠。采用改良同种异体移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型[1]。造模1 周后，随机选取3 只大鼠脱颈处死，固定于手术板上，常规消毒后，打开腹腔，肉眼观察并取出造模大鼠腹腔内异位组织，用生理盐水冲洗2～3 次，清洗掉血块和多余的脂肪组织，放置在4%甲醛中以固定，随后进行石蜡切片HE染色，在显微镜下观察异位组织的形态学结构和特点，镜下显示有丰富的血管生成，并有大量腺体存在，说明造模成功。将造模成功的子宫内膜异位症大鼠随机分为模型组、中药低剂量组、中药高剂量组，行假手术操作的大鼠为假手术组，未经过任何处理的大鼠为空白组。

1.4 给药方法 中药低剂量组：每日灌服中药低剂量组药物（相当于人临床用药量10 倍）1 mL/100 g 大鼠，连续给药至处死；中药高剂量组：每日灌服中药高剂量组药物（相当于人临床用药量20倍）1 mL/100 g大鼠，连续给药至处死；空白组、假手术组、模型组：与其他组同时开始灌服蒸馏水1 mL/100 g 大鼠，连续灌服至处死。

1.5 合笼 给药3 周后，将各组雌鼠分别与平行喂养的雄鼠以2:1 合笼交配，第2 天8:00 am 检查，如果阴道涂片显示有精子者视为交配成功，记录为孕0 天。交配期为2～3 周。

1.6 观察指标及判断标准

1.6.1 一般状态 试验期间每天观察已孕大鼠的活动、行为、步态和对外界的反应情况，记录死亡情况，记录摄食量，每周 2 次测量并记录体质量。

1.6.2 胎仔发育毒性 在已孕母鼠孕20 d 时，每组随机选取8 只，采用颈椎脱臼法处死，检查所有胎仔的存活和畸形情况。观察胚胎颜色和外形。将胎盘与胎鼠剥离后，称体质量。从头向肛门检查胎鼠的外观是否存在畸形；测量胎鼠身长、尾长。将一部分胎鼠置于浓度为95%的乙醇液中固定48 h 后，移入到1% 的KOH 溶液中，2 d 后去除内脏和脂肪，再移入1%的KOH 溶液中透明3～5 d，直至骨骼清楚，将胎仔再移入0.005%的茜素红溶液中染至桃红色，最后再次移入透明液中，2 d 后在显微镜下观察各部位骨骼形态是否存在异常的情况。外观畸形判断标准[2]，见表1。

表1 大鼠、小鼠常见外观畸形特征

1.6.3 围产期发育毒性 每组随机留取8 只妊娠母鼠自然分娩并饲养其子代至21 d 离乳，观察其存活率和生长发育情况。离乳前体格发育正常的标志有耳廓张开、毛发生长、门齿萌出等。从每窝中随机选择雌、雄子代各1只，常规饲养至成年，期间不接触任何药物，然后进行交配以检测其生殖能力。

1.7 统计学方法 应用SPSS 17.0 进行数据的统计分析，计量资料满足方差分析条件者（各组均服从正态分布且方差齐），采用单因素方差分析检验，两两比较用SNK法或LSD法；若不满足方差分析条件者（不服从正态或方差不齐），采用多个独立样本的非参数检验。数据描述均采用均数标准差（）表示。计数资料采用χ2检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜异位症大鼠造模结局判定 造模1 周后随机抽取3 只造模大鼠处死判定造模结局，结果显示：3 只大鼠肉眼观察均可见异位内膜在肠系膜上生长良好，呈隆起囊状小包块，活动度小，内含黏液，上有丰富的血管。HE 染色显微镜下显示异位病灶组织有丰富的血管生成，并有大量腺体存在，说明造模成功，造模成功率100%。

2.2 一般状态 试验期间各组孕鼠的活动、行为、步态和对外界的反应情况正常，摄食量各组比较无明显差异。孕期各组大鼠体质量平稳增长，各组间体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组均未见大鼠死亡情况。见表2。

2.3 大鼠胎仔发育毒性结果比较 孕20 d 每组选取8只孕鼠处死，对各组大鼠平均胎鼠数、胚胎体质量、胚胎身长、胚胎尾长进行比较；将各组胎鼠制作成胎仔骨骼标本以观察骨骼缺失、畸形情况。

2.3.1 各组大鼠胎仔生长发育主要指标比较 各组大鼠平均胎鼠数比较，结果显示：模型组平均胎鼠数明显低于空白组、假手术组、中药低剂量组、中药高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药低剂量组平均胎鼠数与空白组、假手术组比较无明显差异（P＞0.05），但中药高剂量组平均胎鼠数高于空白组（P＜0.05）。各组大鼠胎仔体质量比较，结果显示：模型组胎鼠体质量与空白组、假手术组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中药低剂量组、中药高剂量组胎鼠体质量低于空白组、假手术组、模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药低剂量组与中药高剂量组胎鼠体质量相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

各组大鼠胎仔身长比较，结果显示：模型组胎鼠身长与空白组、假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中药低剂量组、中药高剂量组胎鼠身长低于空白组、模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药低剂量组与中药高剂量组胎鼠身长相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

各组大鼠胎仔尾长比较，结果显示：模型组与空白组、假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中药低剂量组尾长低于模型组（P＜0.05），中药高剂量组尾长低于空白组、模型组（P＜0.05）；中药低剂量组与中药高剂量组胎鼠尾长相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 各组大鼠体质量比较（，n =8） g

表2 各组大鼠体质量比较（，n =8） g

表3 各组大鼠孕20 d 胚胎生长发育主要指标比较（，n =8）

表3 各组大鼠孕20 d 胚胎生长发育主要指标比较（，n =8）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.3.2 各组大鼠的胎仔骨骼标本观察 妊娠20 d 大鼠的胎仔骨骼标本观察结果显示，各组胎仔骨骼均并未出现明显缺失和畸形。

2.4 大鼠围产期毒性结果比较

2.4.1 大鼠子代断乳后存活率比较 各组留取8 只孕鼠自然分娩，大鼠子代在哺乳21 d 后断乳，比较各组大鼠子代存活率、畸形率、死亡率。结果显示：离乳前各组子代大鼠体格发育正常，均可见耳廓张开、毛发生长、门齿萌出；各组大鼠子代畸形率、死亡率、存活率之间无明显差异（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠子代断乳后存活率比较（）

表4 各组大鼠子代断乳后存活率比较（）

2.4.2 各组大鼠子代断乳后体质量比较 各组大鼠子代断乳后体质量比较，结果显示：空白组、假手术组、模型组之间体质量无明显差异（P＞0.05）；中药低、高剂量组子代大鼠体质量高于空白组、假手术组、模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药高、低剂量组之间无明显差异（P＞0.05）。见表5。

表5 各组大鼠子代断乳后体质量比较（）

表5 各组大鼠子代断乳后体质量比较（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05

3 讨论

“疼痛、不孕、复发”是子宫内膜异位症的三大难题[3-5]，子宫内膜异位症可从排卵、受精、着床等多个方面对妊娠产生负面影响。EM 根据临床症状，可以归属于中医的“痛经”“不孕”“癥瘕”“月经失调”“血瘕”等范畴[6-8]。“血瘀”是子宫内膜异位症的公认病机，临证治疗多以活血为主要治则，常用莪术、三棱、丹参、赤芍等药物。传统中医药理论很早就有妊娠禁忌的概念，主要考虑药物可引发流产、堕胎等可能，按药物的副作用大小，分为禁用和慎用两类[9]。活血消异方源自李光荣教授治疗子宫内膜异位症系列经验方，由赵瑞华教授结合子宫内膜异位症现代疾病特点化裁而来，强调从郁论治，其组方以解郁活血为准则，包括莪术、丹参、赤芍等妊娠禁用、慎用的活血消癥类中药。中医药治疗子宫内膜异位症疗程一般在3 个月以上，尤其对于有生育要求的子宫内膜异位症患者，常根据患者排卵情况周期用药，用药期间允许患者试孕，这就使得中药的生殖发育毒性的研究尤为重要[10-12]。

本研究结果发现，孕20 d 模型组大鼠平均胎鼠数量少于其他各组（P＜0.05），模型组胎鼠体质量、身长、尾长与空白组、假手术组比较无明显差异（P＞0.05）；结合前期生殖力与早期胚胎毒性结果，提示子宫内膜异位症疾病本身可能通过影响着床从而在一定程度上降低大鼠生殖能力，但对早期胚胎发育、胎仔发育无明显毒性。活血消异方高、低剂量组平均胎鼠数明显高于模型组（P＜0.05），活血消异方高剂量组平均胎鼠数甚至高于空白组（P＜0.05），但活血消异方高、低剂量组胎鼠体质量、身长、尾长明显低于空白组及模型组（P＜0.05），考虑可能与胎鼠数量较多有关；各组胎仔骨骼均未出现缺失和畸形，离乳前各组子代大鼠体格发育正常，断乳后子代畸形率、死亡率、存活率之间无明显差异（P＞0.05），且中药低、高剂量组子代断乳后体质量高于空白组、假手术组、模型组（P＜0.05）。研究结果初步证实，活血消异方对子宫内膜异位症大鼠胎仔、围产期发育并无明显毒性。

中药治疗疾病以复方为主，根据中药配伍规律指导，临床不良反应相对较少。目前中药复方研究，仍集中于对临床疗效的观察或对作用机制的探讨，对于中药毒性，尤其是生殖毒性的研究仍比较欠缺。随着天然药物中毒事件不断增多，重新认识中药生殖毒性的意识逐渐提高[13]，对无明显毒性中药乃至保胎类方剂、单味药的胚胎毒性、遗传毒性安全性研究发现,菟丝子[14]、桑寄生[15]等药物具有潜在的遗传毒性，水蛭有显著堕胎作用[16]，僵蚕能显著降低小鼠子宫重量及妊娠率[17]，长期、大量使用大黄可对卵巢储备造成影响[18]。生殖毒性的研究，对保证临床用药安全有重大意义，本系列研究就活血消异方的生殖毒性进行了初步探讨，但使用动物模型仅为大鼠，未来仍需进一步研究验证。