防己诺林碱对去卵巢小鼠骨代谢及骨微结构的影响

周琳 杨明理 王博浯 赵毅 曾春平

1. 广州医科大学附属第五医院内分泌科，广州医科大学第五临床学院，广东 广州 510700 2. 遵义医科大学医学遗传学教研室，贵州 遵义 563000

骨质疏松是一种严重威胁人类健康的疾病，主要表现为骨密度减少，骨脆性增加，骨折发生率增高。骨质疏松伴髋骨骨折患者5年内的死亡率比预期高出20个百分点[1]。骨质疏松以绝经后骨质疏松最为常见，这是因为绝经后雌激素不足会导致骨重塑不平衡，骨吸收作用大于骨形成，从而导致骨折风险增加[2]。防己诺林碱(Fangchinoline)是从防己科植物粉防己和盾状轮环藤等植物的根部分离、纯化的主要有效成分，为五环三萜皂苷，水溶性及稳定性良好。研究表明，防己诺林碱具有多种药理作用，包括抗炎[3]、抗氧化应激[4]和神经保护作用[5]。且其同源类似物汉防己甲素具有抑制破骨细胞活性和骨保护作用[6]。据此，推测防己诺林碱对骨质疏松有保护作用。本实验用去卵巢小鼠骨质疏松模型探讨防己诺林碱对绝经后骨质疏松的保护作用，为骨质疏松的临床用药提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验药物：防己诺林碱 (纯度≥98%)购自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.2动物：C57BL/6雌性小鼠40只，7周龄，体质量约20 g，购于重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号：SCXK(渝)2017-0003。所有小鼠在动物房适应性饲养1周后开始实验。

1.1.3试剂：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)、I型胶原羧基末端肽(CTX)及I型胶原氨基末端肽(NTX)ELISA试剂盒购自北京北方生物技术研究所。雌二醇购自北京索莱宝公司。TRIZOL购买于美国invitrogen公司，Real-time PCR反应试剂SYBR©Premix Ex Taq购于大连TaKaRa公司。

1.1.4仪器：Skyscan 1174微型计算机断层扫描仪(Micro-CT，比利时Bruker公司)；Gen5型多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组：将40只8周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为4组，分别为空白(假手术)对照组、模型(去卵巢)组、阳性(雌二醇，E2)对照组、防己诺林碱组，每组各10只。

1.2.2造模及给药：用10%水合氯醛将小鼠麻醉后，在两侧腹背部做0.5 cm切口，依次剥开皮肤、腹肌、腹膜、脂肪团，切除双侧卵巢。空白(假手术)对照组仅切除卵巢附近的同体积脂肪组织，余操作同卵巢切除小鼠。手术恢复1周后开始给药，防己诺林碱组隔日经腹腔注射1 mg/kg防己诺林碱。阳性(雌二醇)对照组隔日经腹腔注射50 ng/kg雌二醇。空白对照组和模型组注射相同剂量的生理盐水。

1.2.3体重测定：在小鼠行卵巢切除术(小鼠8周龄)时称重一次，给药中(小鼠12周龄时)称重一次，处死小鼠(小鼠16周龄)时称重一次。记录小鼠体重变化。

1.2.4小鼠血清钙、磷、TRAcP、CTX、NTX的测定：手术8周后，将所有小鼠采用眼球摘除法取血，2 000 r/min离心10 min，取上层血清，放置于-80 ℃备用。用ELISA试剂盒检测血清钙、磷水平及TRAcP、CTX、NTX含量。

1.2.5骨微结构指标测定：手术8周后，处死小鼠，取一侧股骨。用micro-CT检测并分析小鼠股骨的骨小梁百分比(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.2.6小鼠骨组织骨质疏松相关基因检测：手术8周后，取小鼠另一侧股骨，将小鼠股骨干骺端在液氮中研磨成粉，按照TRIZOL说明书进行操作，从股骨干骺端提取RNA。用1μg 总RNA通过oligo-dT 引物逆转录成cDNA，检测破骨细胞标志基因的扩增情况。引物设计如下：TRAcP (forward：5’-TGT GGCCATCTTTATGCT-3’；reverse：5’-GTCATTT CTTTGGGGCTT-3’)；Cathepsin K (forward：5’-GGG AGAAAAACCTGAAG-3’；reverse：5’-ATTCTGG GGACTCAGAGAGC-3’)；NFATc1 (forward：5’-CAA CGCCCTGACCACCGATAG-3’；reverse：5’- GGC TGCCTTCCGTCTCATAGT-3’)；CTR (forward：5’-TGGTTGAGGTTGTGCCCA-3’；reverse：5’-CTCGT GGGTTTGCCTCATC-3’)；GAPDH (forward: 5’-ACC ACAGTCCATGCCATCAC-3’；reverse：5’-TCCA CCACCCTGTTGCTGTA-3’)。PCR反应结束后，以GAPDH 基因为内参，计算各基因的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 防己诺林碱对OVX小鼠体重的影响

在小鼠行卵巢切除术即小鼠8周龄时，各组小鼠体重无明显区别。在给药中即小鼠12周龄时，模型组较空白对照组体重上升，差异有统计学意义，其余各组体重差异无明显区别。处死小鼠即小鼠16周龄时，模型组及防己诺林碱组较空白对照组体重明显上升，E2组体重较模型组显著下降，防己诺林碱与模型组体重无明显差异，E2组与空白对照组体重无明显差异(表1)。

表1 防己诺林碱对小鼠体重的影响Table 1 Effect of fangchinoline on mice weight g)

2.2 防己诺林碱对OVX小鼠骨质疏松相关血清学指标的作用

ELISA检测结果显示，各组之间血清钙、磷水平无显著差异。与模型组相比较，防己诺林碱组及E2组TRAcP、CTX和NTX水平显著降低。与空白对照组相比，防己诺林碱组及E2组的TRAcP、CTX和NTX含量差异无统计学意义(表2)。

表2 防己诺林碱对小鼠骨质疏松血清学指标的作用Table 2 Effects of fangchinoline on osteoporosis related biomarkers in mice

2.3 防己诺林碱对OVX小鼠骨量流失的作用

Micro-CT结果显示，与模型组相比较，防己诺林碱组及E2组BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著升高，Tb.Sp明显降低。与空白对照组相比，防己诺林碱组及E2组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th及Tb.Sp差异无统计学意义(图1，表3)。

表3 防己诺林碱对去卵巢小鼠股骨骨微结构的作用Table 3 Effects of fangchinoline on femoral microarchitecture in ovariectomized

图1 防己诺林碱对去卵巢小鼠股骨近端骨微结构的影响Fig.1 Effects of fangchinoline on femoral microarchitecture in ovariectomized mice

2.4 防己诺林碱对OVX小鼠骨组织骨质疏松相关基因的作用

实时荧光定量PCR检测结果表明，与模型组相比较，防己诺林碱组及E2组破骨细胞标志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)显著降低。与空白对照组相比，防己诺林碱组及E2组的破骨细胞标志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)差异无统计学意义 (表4)。

表4 防己诺林碱对小鼠骨组织骨质疏松相关基因的作用Table 4 Effects of fangchinoline on osteoporosis related genes expression in

3 讨论

骨质疏松症已经成为严重威胁人类健康的疾病。骨重建包括骨形成和骨吸收两个相互平衡的过程，分别由成骨细胞和破骨细胞调控，当破骨细胞的骨吸收功能超过成骨细胞的骨形成，即引起骨质疏松[7]。目前常用的骨质疏松药物有双膦酸盐和雌激素，然而这些抗骨质疏松药物各有缺点，例如双膦酸盐与下颌骨坏死及非典型股骨转子下骨折风险相关；雌激素则会提高乳腺癌及子宫癌的发病风险[8]。因此，寻找有效安全的抗骨质疏松药物具有重要意义。中医药具有较高的安全性和有效性[9]，通过多个机制发挥对骨质疏松的防治作用，例如具有类雌激素、抗氧化、抗炎症反应等作用，以及通过调节多条信号通路抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞分化[10]。因此，中医药有望成为防治骨质疏松的主要手段之一。

防己诺林碱是从防己科植物粉防己和盾状轮环藤等植物的根部分离、纯化的主要有效成分，为五环三萜皂苷，水溶性及稳定性良好。研究表明，防己诺林碱具有抗炎、抗氧化应激等多种药理作用[3-5]，提示防己诺林碱可能具有骨保护作用。雌激素能抑制破骨细胞功能，同时促进成骨细胞功能。绝经导致的雌激素低下是诱发骨质疏松症的重要原因。去卵巢小鼠模型是模仿绝经后妇女生理特征而设计的一种成熟的动物模型，成功模拟了因雌激素缺乏而导致的骨质疏松[11]。因此，本研究采用去卵巢小鼠模型研究防己诺林碱对骨质疏松的保护作用。根据预实验结果，本次实验选取1 mg/kg浓度的防己诺林碱进行动物实验。实验结果表明，相较于空白对照组，去卵巢模型小鼠体重明显升高，这是因为较低水平的雌二醇能导致体重增加；E2组体重较模型小鼠明显下降，与空白组无明显区别，这是雌激素替代的生理结果。防己诺林碱组体重也较空白对照组明显升高，与模型组小鼠无明显区别，说明防己诺林碱对去卵巢导致的体重增加无明显作用。经防己诺林碱处理后，去卵巢小鼠骨吸收相关血清学指标TRAcP、CTX、NTX水平明显下降；BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著升高，Tb.Sp明显降低，E2组也有相似的结果。以上结果表明，防己诺林碱有提升骨量、改善骨质疏松的作用，各组间血钙和血磷含量无明显区别。这可能是因为雌激素可以抑制甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)[12]，降低血钙，同时雌激素还可抑制骨钙素，升高血钙，因此雌激素对钙磷代谢无明显作用。同时去卵巢手术和防己诺林碱对钙磷代谢也无明显作用，因此各组血钙和血磷无明显区别。经防己诺林碱处理后，去卵巢小鼠破骨细胞标志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)表达水平明显下降，提示防己诺林碱的骨保护作用可能与抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能有关，其作用的具体分子机制值得进一步深入研究。

综上所述，本研究表明防己诺林碱对去卵巢引起的骨量流失具有保护作用，为其应用于骨质疏松症的治疗提供了实验依据。