真武汤治疗新型冠状病毒感染的网络药理学研究：基于五运六气理论

朱红俊，陆 曙

(南京中医药大学无锡附属医院 心血管科，江苏 无锡 214071)

新型冠状病毒(COVID-19)是一种全新的病毒，目前我们对其认识还不足，但COVID-19具有传染性强、传播速度快等特点，属于中医瘟疫的范畴。几千年来，中医药在防治瘟疫方面积累了丰富的经验，并形成了独特的理论体系，五运六气理论是其中最重要的理论之一。

在五运六气理论中，世界由五种稳定的势态和六种变化的时态构成[1]。五种势态包括木、火、土、金、水五运；六种时态包括太阳、少阳、阳明、厥阴、少阴、太阴六气。

根据五运六气理论，笔者认为COVID-19病毒感染属于土运的势态不足；时态变化则是从太阳和少阴开始，在这个阶段得到扭转疾病就会好转，否则，疾病就会迅速进展到太阴时态，发展成COVID-19肺炎以及危重状态。针对这种疾病特点，中医经典书籍《伤寒论》中的真武汤可以有效治疗。

中国中医科学院仝小林院士认为本病特点属于“寒湿”，这也是真武汤的适应证。国家中医药管理局《关于推荐在中西医结合救治新型冠状病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒汤”的通知》(国中医药办医政函[2020]22号)中推荐的清肺排毒汤临床治疗COVID-19感染效果很好，其处方也含有真武汤5种草药中的3种：白术、茯苓、生姜。

本研究基于五运六气理论，通过网络药理学分析，探讨真武汤与COVID-19肺炎在有效成分、作用靶点及通路等方面的联系，探索其潜在的作用机制，为中医药治疗COVID-19提供一定的理论基础与科学依据。

1 材料与方法

1.1 真武汤相关靶点筛选

通过计算系统生物学实验室[2](https：//tcmspw.com/)检索真武汤中5味中草药附子、白术、白芍、茯苓、生姜作用的蛋白质靶点，并在Uniprot蛋白质数据库(https：//www.uniprot.org)，对蛋白质靶点进行规范。

1.2 COVID-19肺炎相关靶点预测筛选

以“pneumonia”为疾病关键词，在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org)中进行数据挖掘，得到与COVID-19肺炎相关的靶点。

1.3 真武汤成分-靶点PPI网络构建

利用Venny2.1.0工具取药物靶点与疾病靶点的交集，并将交集靶点提交至String11.0 数据库(https：//string-db.org)构建蛋白互作(PPI)网络[3]。生物种类设定为“Homo sapiens”，参数设定为默认设置，并通过MCL聚类分析挖掘核心蛋白组团。

1.4 真武汤-COVID-19肺炎交集靶点功能与通路富集分析

采用David6.8对真武汤化学成分靶点与COVID-19肺炎靶点的交集的靶点进行GO 富集分析，分析生物学过程；利用KEGG 通路分析，分析代谢通路，并进行蛋白功能区域分析。保存数据结果，以P<0.01进行筛选。

1.5 真武汤药物成分-靶点-通路网络图的构建

检索真武汤中5味草药的全部化学成分，挖掘所有化学成分的相关靶点，与47个交集靶点相比对，筛选出作用于47个交集靶点相关的化学分子。

运用Cytoscape3.7.2构建真武汤成分-靶点-通路网络图，利用Cytoscape3.7.2内置工具分析有效成分及靶点的网络连接度(Degree)，并根据Degree参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 真武汤中草药靶点的数据挖掘

经检索得到附子作用靶点68个、白术作用靶点259个、白芍作用靶点646个、茯苓作用靶点69个，生姜作用靶点685个，合计1 727个，删除重复值后真武汤中5种草药的作用靶点总计778个。

2.2 COVID-19肺炎相关靶点的数据挖掘

COVID-19肺炎相关靶点合计检索到4 473个。采用Venny 2.1工具取真武汤草药靶点和COVID-19肺炎相关靶点的交集，得到交集靶点47个(见表1)。

2.3 交集靶点的PPI网络构建

将筛选得到的47种药物-疾病交集靶点上传到String11.0平台，构建得到PPI网络(见图1)。可以发现PNMT(苯乙醇胺N-甲基转移酶)、HDAC8 (组蛋白脱乙酰酶8)游离于网络之外，与其他蛋白没有相互作用。通过MCL聚类分析，提取了以GAPDH、CAT和HMOX1、TNF和ICAM1为中心的3个核心蛋白质功能团。

2.4 靶点功能与通路的富集分析

采用David6.8进行47个交集靶点功能与通路的富集分析，并以P<0.01进行筛选。GO富集分析得出107个生物学过程，其中P<0.01的生物学过程有30个；KEGG通路富集分析得出62个靶点通路(P<0.01)。蛋白功能区域SMART分析显示，交集靶点主要作用在ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2五个蛋白功能区域。表2、表3、表4分别列举出了前10个功能、通路和5个蛋白域。

表1 真武汤草药和COVID-19肺炎相关靶点的交集靶点

2.5 真武汤成分-COVID-19肺炎相关靶点-通路网络图的构建

经检索并去除不同草药中的重复成分，总计检索出真武汤300种不同化学分子成分。检索出300种分子的所有靶点，与真武汤-疾病交集靶点进行比对，筛选出与47个靶点相关联的真武汤化学分子共计95种。采用Cytoscape3.7.2软件构建真武汤-中药-分子-靶点网络构建(见图2)，以软件自带的工具进行网络分析，根据Degree值进行排序。

分析结果显示，真武汤5种中草药中，生姜、白芍在网络中的重要性较高；47个靶点中，溶菌酶、孕激素受体、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子、钾电压门控通道亚科H-2在网络中重要性较高；95种化学分子中，醋酸、山柰酚、水杨酸、棕榈酸、甘氨酸的重要性较高。表5、表6、表7分别列出了5种中药排序、前10位的化学分子和靶点的排序。

表2 Go分析前10位交集靶点相关生物学过程

表3 KEGG分析前10位交集靶点相关通路

表4 交集靶点的蛋白域

图1 真武汤-COVID-19肺炎交集靶点PPI网络

图2 真武汤-中药-分子-靶点网络

表5 真武汤草药Degree值排序

表6 交集靶点关联的真武汤化学分子Degree值前10位

表7 真武汤和COVID-19肺炎交集靶点Degree值前10位

根据分析数据，采用真武汤5味草药的排序前10个化学分子，以及排序前10位基因靶点、生物学过程及信号通路，重新构建真武汤-中药-分子-靶点-通路网络(见图3)。

如图3可见，排序靠前的10靶点只能涵盖前6个生物学过程，但可以涵盖前10个通路。其中，TNF最为关键。TNF细胞因子是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，可能和COVID-19感染的炎症反应有关。通过KEEG BRITE查询得到TNF信号通路机制(见图4)。图4中可见：TNF有TNFR1、TNFR2的2个信号通路环节。其中MAPK信号通路参与了TNFR1介导的信号传递过程。而真武汤-COVID-19肺炎47个交集靶点中包含了MAPK信号通路中的5个靶点：MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK10、MAPK14。这提示，真武汤是作用于TNFR1介导的TNF信号通路。

图3 真武汤-中药-分子-靶点-通路网络

图4 TNF信号通路

3 讨论

3.1 真武汤治疗COVID-19肺炎的五运六气理论分析

新型冠状病毒(COVID-19)可能起源于蝙蝠，发生跨界侵袭感染人类的具体时间尚不清楚，但出现临床症状而被发现、报道的时间在2019年年底，也就是主气的六之气太阳寒水阶段。

2019是己亥之年，土运不及，厥阴司天，相火在泉。《素问·六元正纪大论》云：“凡此厥阴司天之政，气化运行后天……天气扰，地气正，风生高远，炎热从之，云趋雨府，湿化乃行。”经义符合新型冠状病毒感染湿象明显的特点。2019年六之气时，主气太阳寒水、客气少阳相火。太阳寒水人体阳气潜藏，但客气少阳相火其性为阳，与人体的阳气两气相感，导致浮阳游离，少阴肾气有隙，邪气中人及入，逆冲于太阴，与湿气交浑，故湿、热皆本为时之常气，湿为太阴，热为浮阳。因此，临床见苔腻而热不高，但邪蕴于其中而为患，故湿为象，邪为本。

因此，从运气学来分析，新型冠状病毒感染是太阳少阴两感于邪，上逆于太阴肺经。临床根据不同时机与临床疾病之病象选择麻黄附子细辛汤、真武汤等是可行性的方案。

3.2 真武汤治疗COVID-19肺炎的病理及运气理论分析

COVID-19肺炎危重症导致死亡的原因很多，但直接的原因是缺氧。病理研究结果显示，患者肺泡被黏液所覆盖，气体交换功能丧失，类似溺水[4]。从中医角度讲，这是气机的升降出入出现了严重问题，孤阳不生，缺氧一旦出现，全身脏器都会衰竭，心、脑、肾首当其冲。肺伤，大气孤绝；脑伤，神游在外；心伤，寒饮上逆阳气外绝，肾伤，关格窿闭三焦不通。无论哪一种，预后均极差，死亡迅速。

治疗的首要是祛邪。邪为疫毒，其性难了，但邪不空见，必依附于正气，随气升浮，气出邪去。湿为标，邪为本，湿去邪出，治湿不利小便非其治也。不论国家诊疗方案中的五苓散，还是临床广泛运用的三仁汤、银翘散、甘露消毒丹、藿朴夏苓汤等，临床均有效验。诸方中也均有淡渗利湿、甘淡去湿等药物。目的在于利湿导邪，而非只为祛湿。

病理分析结果表明，本病危险在肺泡阻隔，技术上可能及时进行肺灌洗可提高成功率。但这对于医务人员的风险较大。ECMO理论上可帮助抢夺抢救时间，但尽早获得ECMO支持较难。因此，尽早进行中医干预非常重要。

对30例医务人员感染症状的分析显示：感染COVID-19病毒后，咳嗽占83.33%、发烧占76.67%、疲劳占70%，其他症状还有头痛、恶心、呕吐或腹泻、呼吸困难等[5]。在发热、干咳、乏力这三大主症中，核心在干咳，发热反而不是最关键的症状。干咳不好，热退也作用有限。当然，热退提示炎症反应降低，有一定意义。乏力是宗气大衰的表现，是机体缺氧的结果，因此，不能到氧饱和度下降才干预，有乏力就应当及时氧疗。

临床见到干咳应积极干预阻断，也许可以大大增加获救的机会，这是疾病规律决定的。中药处方中合用淡渗或甘淡之品，也许可以减轻肺泡水肿炎症渗出的可能。

大疫当前，临床有出现特效方剂的可能，但疾病的复杂性也决定了依靠一方一药防治COVID-19肺炎是有难度的，目前临床有效的经验也没有局限在一个方药上。但临床处方应当有主线，有核心处方。

COVID-19肺炎疾病的发展过程清晰展示了太阳外感(感毒)、内陷少阴(免疫反应)、上逆于太阴(肺炎)的过程。因此，以真武汤为核心，配伍三甲散分消主客、射干麻黄汤治疗咳嗽、麻杏石甘汤治疗发热、五苓散导利湿邪等。当然，以银翘散替换麻杏石甘汤、三仁汤、藿朴夏苓汤、泽漆汤等替换五苓散均可行。轻症也可以不用三甲散，但难治干咳或有内陷迹象的须用。主客交浑，不能分消主客则邪毒难去。

3.3 真武汤治疗COVID-19肺炎的网络药理学分析

如前文所言，真武汤可以作为治疗COVID-19肺炎的核心处方。但这除了理论和临床分析外，还需有现代机制的支持。

本文经过网络药理学分析显示：尽管临床普遍将真武汤归入附子类方，但真武汤中起主要作用的草药是生姜、白芍、白术，而不是附子。真武汤主要化学分子是醋酸、山柰酚、水杨酸、棕榈酸、甘氨酸、谷甾醇等；主要作用靶点是溶菌酶、孕激素受体、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子、钾电压门控通道亚科H-2等。核心蛋白质功能团分别以GAPDH、CAT和HMOX1、TNF和ICAM1为中心，蛋白功能区域集中在ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2等，主要生物学过程为序列特异性DNA结合转录因子活性的调控、MAPK活性的激活、过氧化氢分解代谢过程、环化酶活性的正调控、上皮细胞分化等。主要干预的通路包括2型糖尿病、NOD样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、弓形体病、Fc-εRI信号通路、甲型流感等。

这个研究结果显示了真武汤干预COVID-19肺炎的机制，也提示了COVID-19肺炎这个新型疾病的部分临床现象的机理。

2型糖尿病相关通路与COVID-19肺炎高度相关。这提示糖尿病患者是COVID-19病毒的易感人群，而真武汤可以调节胰岛素受体，提高糖尿病人群的抗COVID-19感染能力。

目前认为，COVID-19病毒主要是通过血管紧张素转化酶(ACE-2)建立对人体的攻击路径。具有ACE-2表达的肺细胞可能是COVID-19感染期间的主要靶细胞[6]。不能忽视的是，ACE-2在体内分布以心、肾最多，其次是肠和肺，而COVID-19病毒感染却以肺炎为最严重、最突出的表现。因此，ACE-2介导途径之外可能存在其他机制，这是一个合理的推测。目前认为FURIN[7]、GRP78[8]和CD147[9]也与COVID-19病毒感染途径有关，其中，FURIN在GeneCards数据库可以检索到，也在本文检索结果中，但不在交集靶点中。

此外，ACE-2在心、肾分布较多，但COVID-19病毒感染后肺部损伤更为突出。考虑到肺部与心、肾不同的气体接触环境，这个差异是否与过氧化氢酶、髓过氧化氢酶、过氧化物酶体增殖体激活受体等过氧化反应有关，也是值得关注和研究的方向。

对于不同人群COVID-19病毒易感性的研究认为，相对于女性，男性更容易感染COVID-19病毒。对30例感染COVID-19病毒的医务人员分析显示，男女感染比例为2∶1[5]。目前认为，这可能与ACE-2受体男女分布差异有关。本文结果显示，孕激素受体、雄性激素受体和COVID-19肺炎相关，也许提示了COVID-19病毒感染性别分布差异的其他机制。

上述分析结果与蛋白组团的解析结果也一致。GAPDH核心蛋白功能团包括了AR、INSR，这提示了糖尿病、性别是易感因素。CAT-HMOX1核心蛋白功能团与过氧化机制相关，这提示了肺组织易感性。TNF-ICAM1核心蛋白功能团则提示了炎症反应的中心机制。

蛋白功能区域的分析显示，真武汤治疗COVID-19病毒感染的机制与ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2五个蛋白功能区域有关。其中，ZnF_C4是核激素受体中的C4锌指。锌指(Znf)结构域是一种相对较小的蛋白基序，它包含多个指状突起，与靶分子相互串联。其中一些结构域与锌结合，具有多种RNA识别模式[10]。目前临床治疗COVID-19病毒感染的治疗方案中，韩国方案包含了锌剂治疗，临床有效，推测其机制可能与ZnF_C4蛋白功能区域有关。真武汤具有相似的效果。

至于钾电压门控通道亚科H-2也许与重症COVID-19肺炎猝死有关。

此外，本文分析结果也许可以提供一些预防COVID-19病毒感染的生活建议。本文结果显示，真武汤有效药物中生姜排序位列第一；有效分子中醋酸、水杨酸、甘氨酸排序靠前；锌指是关键蛋白功能区域。因此，生姜、食醋以及含甘氨酸、含锌的保健食品也许可以作为预防COVID-19病毒感染的食疗方法。但这应该理性看待，过犹不及，适量就好。

综上所述，在五运六气理论指导下，选择真武汤治疗新型冠状病毒感染及相关肺炎具有理论基础与科学依据，对当前疫情防控具有一定价值。