基于数据挖掘和网络药理学的《临证指南医案·淋带》用药研究*

2020-11-23黄羚，江媚

天津中医药 2020年11期

黄羚，江媚

（北京中医药大学，北京 100029）

叶天士聪敏好学，不仅医术高超而且医德高尚，一生临证不辍，为后世留下了宝贵的经验。其作《临证指南医案》思路清晰，文字简约，可谓真才实学，被后世奉为医案学习的典范，有很高的参考价值。本研究借助中医传承辅助平台挖掘《临证指南医案·淋带》的用药规律，并通过网络药理学方法对叶天士的用药经验进行疾病靶点的关联研究，充分挖掘以叶天士治疗淋带的现代药理学意义，为临床治疗女性泌尿生殖系统疾病提供理论依据。

1 研究对象

选录自叶天士《临证指南医案·淋带》[1]，选取患者病案，记录全部诊次组方。

2 方法

2.1 资料录入及处理将上述筛选后的病案资料录入中医传承辅助系统（TCMISS）2.5版本，由双人负责审核。通过“数据分析”模块中的“方剂分析”功能，进行用药规律挖掘。统一药物名称，如“湖莲”及“建莲肉”输入为“莲子”，“川斛”输入为“石斛”，“樗根皮”输入为“椿根皮”，“柏子仁霜”输入为“柏子仁”。对于系统中不能自动生成的药物进行手工输入，无剔除药物。

2.2 《临证指南医案·淋病》治疗淋带组方数据分析

2.2.1 频次统计分析将医案中每首方剂中每味药的出现频次从大到小排序，对药物的性味归经属性进行统计，由大到小排序，以各属性的数量与分类总数量的比值为所占比，分别将结果导出。

2.2.2 性味归经分析依据《中华人民共和国药典》标准，将频次≥3次的药物16味药物的四气（寒、凉、温、热、平）、五味（酸、苦、甘、辛、咸、涩）、归经（肝、心、脾、肺、肾、胆、小肠、胃、大肠、膀胱、三焦及心包经）进行统计。

2.2.3 组方规律分析 “支持度个数”设为4（支持度为8.0%），置信度设为0.6，按药物组合出现频次从大到小的顺序进行排序；点击“规则分析”分析所得的规则。

2.2.4 新组方分析结合临床经验和不同参数的数据预读，设置相关度为5，惩罚度为2，进行聚类分析；以改进的互信息法药物关联度分析结果为基础，按照相关度与惩罚度约束，基于复杂系统熵聚类，演化出药物核心组合；在以上核心组合提取的基础上，运用无监督熵层次聚类算法，发现新组方，并进行网络可视化展示。

2.3 《临证指南医案》治疗淋带基本组方机制研究

2.3.1 相关作用靶标数据库的构建在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）、中药网络数据库及分析系统（TCM-Mesh）、中药成分靶点数据库（HIT）、中药信息数据库（TCM-ID）中，预测“茯苓、桑螵蛸、桂枝、牡蛎、阿胶、枸杞子、沙苑子”的靶标，提取共有药物靶标，形成基本组方-中药-靶标联系网络。在人类表型术语集（HPO）、DrugBank数据库、毒性与基因比较数据库（CTD）中，搜索与“淋带”相对应的女性泌尿生殖系统相关的所有疾病，尿路感染、膀胱炎、尿道综合征、泌尿道结核、尿路结石、盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎、宫颈炎、阴道炎等病，获得“女性泌尿生殖系统疾病、泌尿生殖系统疾病、外阴念珠菌病、复发性金黄色葡萄球菌感染、复发性尿路感染”等疾病靶标，提取交集后作为“淋带”的疾病靶标，形成疾病-靶标联系网络。并通过全球蛋白质资源数据库（UniProt）翻译成相应基因。

2.3.2 各靶标间相互作用关系的构建在蛋白质数据搜索工具（STRING）中，选择多种蛋白质后，输入相关靶标名称，在生物中选择人类进行检索，得到相应蛋白关系图，选择分子作用进行分析，记录蛋白间相互作用类型及得分。

2.3.3 治疗淋带组方相关生物功能和通路富集分析在STRING平台进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）的信号通路富集分析和基因本体（GO）的生物过程富集分析，以P＜0.05进行靶基因筛选，分析新组方发挥药理作用的主要信号通路及生物过程，整理相关通路数据。

3 结果

3.1 用药频次在21首处方中，共使用药物54味。使用频次最多的药物是茯苓，使用12次。使用频次≥3次的药物共计16味。依次是茯苓、枸杞子、人参、当归、沙苑子、阿胶、杜仲、莲子、牡蛎、桑螵蛸、芡实、鹿角霜、白芍、五味子、茯神、桂枝。见表1。

3.2 药物性味归经 54味药物的属性中，四气性温的药最多，占44.37%；五味属甘的药最多，占50.00%；归肾经的药最多，均占28.61%。见表2。

3.3 常用药物功用分类基于《中药学》对使用超过2次的中药进行主要功用分类，发现使用频次最多的是补阳气药，如沙苑子、杜仲、鹿角霜、肉苁蓉、鹿茸、菟丝子、补骨脂等。桑螵蛸、芡实、五味子、海螵蛸、禹余粮等收敛药的使用仅次于补阳药。另有安神药、补血药、清热药也是常用配伍，见表3。

表1 方剂中使用频次3以上的药物情况表Tab.1 Drugs with a frequency of more than 3 times in prescriptions 次

表2 方剂中药物性味归经情况表Tab.2 Situation of drug flavor and meridian tropism in prescriptions

3.4 基于关联规则的组方规律得到常用药物组合共30个，频次最大的药物组合为“人参、茯苓”，出现7次；其次为“枸杞子、茯苓”，“当归、枸杞子”，“沙苑子、枸杞子”，各出现6次。在置信度较高的药物组合中，显示沙苑子-枸杞子、桑螵蛸-茯苓、牡蛎-阿胶等为常用药物组合。按出现频次由高到低排序，见表4；分析所得的药对和药物组合的用药规律，见表5。

表3 《临证指南医案·淋带》高频药物功用分类表Tab.3 Classification of high frequency drug function in Guide to Clinical Practice with Medical Record：Lindai

表4 治疗淋带组方中的药物组合（支持度≥4，置信度≥0.6）Tab.4 Drug combination in the prescription for treating lindai(degree of support≥4，degree of confidence≥0.6)

3.5 基于熵聚类的方剂组方规律得到处方中两两药物间的关联度共1 331条，将关联系数0.05以上的药对，治疗淋带组方中的潜在药对共30条，见表6。基于熵聚类算法得出的关联度结果，以相关度与惩罚度为规范，演算出治疗淋带组方中的的核心组合，见表7。基于复杂熵聚类算法的治疗淋带新方，见表8。

3.6 各靶标间的相互作用通过检索，得到治淋带基本组方的靶标基因为1 192个，淋带的靶标基因为52个，经交集显示，药物-疾病交集靶标基因为10个。治淋带基本组方的潜在靶标与疾病靶标之间的蛋白质-蛋白质相互作用信息（PPI）通过STRING获得。网络中包含10个节点，平均局部聚类系数为 0.333，PPI富集 P 值为 0.004 01。见图 1。其中，有5项相关靶标的相互作用，见表9。

表5 治疗淋带组方中药物的关联规则（置信度≥0.75）Tab.5 Association rules of drugs in the prescription for treating lindai(degree of confidence≥0.75)

表6 治疗淋带组方中的潜在药对（关联系数≥0.05）Tab.6 Potential drug combinations in the prescription for treating lindai(correlation≥0.05)

表7 治疗淋带组方中的核心组合Tab.7 Core combination in the prescription for treating lindai

表8 基于复杂熵聚类算法治疗淋带新方组合Tab.8 New prescriptions for treating lindai based on complex entropy dustering

图1 基于STRING的药物—疾病靶标相互作用图Fig.1 Drug-disease target interaction based on STRING

3.7 治淋带基本组方的GO功能富集对交集靶标基因进行GO生物过程富集，筛选到P＜0.05的GO条目57个，按照P值由小到大排列的前20条主要生物过程见表10。结果显示，其GO基因生物功能主要涉及：和生殖系统相关的子宫发育、男性性腺发育、男性原发性特征的发展、男性性别分化；和免疫炎症相关的toll样受体信号通路的正调控、toll样受体信号通路的调控、肿瘤坏死因子产生的调控、中性粒细胞介导免疫、细胞对内源性刺激的反应；和自由基活动相关的呼吸爆发、血管内皮生长因子受体信号通路、超氧阴离子生成；和代谢相关的细胞对L-谷氨酰胺的反应、对醛固酮的反应、过氧化氢生物合成工艺、前体代谢产物和能量的产生、辅助因子代谢过程、电子传输链、粒作用、分泌。

表9 治淋带基本组方的相关靶标相互作用（关系数≥0.417）Tab.9 Related target interactions of the basic prescriptions for treating lindai(confidence≥0.417)

3.8 治淋带基本组方的KEGG信号通路分析筛选出P＜0.05的信号通路共6条，按照P值由小到大排列的KEGG信号通路见表11。分别是利什曼病、白细胞经内皮迁移、吞噬小体信号通路、破骨细胞分化、流体剪切力与动脉粥样硬化、NOD样受体信号通路。

其中，结果显示细胞色素b245轻链抗体（CYBA），细胞色素b245重链抗体（CYBB），中性粒细胞胞质因子2（NCF2）参与了吞噬小体信号通路；CYBA和CYBB参与了NOD样受体信号通路，与女性泌尿生殖系统疾病的炎症免疫反应密切相关。

表10 治淋带基本组方的基因功能分析（前20）Tab.10 Analysis of gene function of the basic prescriptions for treating lindai(top 20)

表11 治淋带基本组方的KEGG信号通路分析Tab.11 KEGG signal pathways analysis of the basic prescriptions for treating lindai

4 讨论

4.1 淋带的病因病机淋带，实为淋证和带下病之合称[2]。淋带对应现代当属泌尿及生殖系统感染相关的疾病。肾虚膀胱气化不利，水积膀胱，日久酿成湿热则气化更失疏利，或肾虚不能上滋心阴，心火过旺，下劫肾水，心阴无源，与肾相表里之腑膀胱受热灼，水道不利而致淋证。带脉失约是目前较公认的“带下”病因病机提要。热、毒、湿、寒、瘀伤及任带二脉，使任脉不固，带脉失约而导致带下病。

4.2 叶天士治淋带思想叶天士对淋带病的病因病机及治法有独特的见解，其医案中实证多以心火下炽、湿热下注为主，治疗以清热利湿，分利清浊为法；虚证可见温邪伤阴、血虚脉滞、血虚风动、津涸风动、肝肾阴虚、阴阳两虚等，治以寒热平调、顾护阴液、不伤阴阳为立法。其核心病因病机多是由于肾水耗竭，不能上济心阴，心肾不交，肾水不能上济心火，心火下迫膀胱、胞宫胞脉导致，治疗宜交通心肾[3]。研究发现，叶天士治疗淋带病的药物中使用频次最多的药物是茯苓，其次是枸杞子、人参、当归、沙苑子、阿胶、杜仲、莲子、牡蛎、桑螵蛸、芡实、鹿角霜、白芍、五味子、茯神、桂枝等交通心肾及滋补肝肾之品；药物的属性中，性温的、属甘的、归肾经的药最多；通过中药主要功用分类，发现使用频次最多的是沙苑子、杜仲、鹿角霜、肉苁蓉、鹿茸、菟丝子、补骨脂等补阳气药；桑螵蛸、芡实、五味子、海螵蛸、禹余粮等收敛药的使用仅次于补阳药，另有安神药、补血药、清热药也是常用配伍；药物组合规律显示沙苑子-枸杞子、桑螵蛸-茯苓、牡蛎-阿胶等为常用药物组合，也体现了其交通心肾、滋补肝肾的治疗法则。

通过熵聚类分析得出叶天士治疗淋带有两个基本方。基本方之一由茯苓、桑螵蛸、桂枝、牡蛎组成。方中茯苓也是叶天士治疗本病使用次数最多的药物，茯苓性甘、淡，甘补扶正，淡渗除湿；桑螵蛸为补肾固精，收涩缩尿之要药；桂枝辛能通阳助膀胱气化，温能散寒湿；牡蛎敛阴固涩，配伍桂枝能调阴阳，和营卫，涩精液，全方共奏下补肾水，上济心火，交通心肾之功。若失治误治，久治不愈，病情迁延，余毒不解，耗气伤津，肾阴渐亏，或素体阴虚，肝肾阴虚而正虚毒恋，虚实夹杂，反复发作，基于“治病求本”的原则，治疗以滋补肝肾为主。基本方之二由阿胶、枸杞子、沙苑子、牡蛎组成。方中阿胶甘，平，归肺、肝、肾经。具有补血滋阴润燥之功。枸杞子甘，平，归肝、肾经，为滋补肝肾良药。沙苑子甘，温，归肝、肾经，具有补肝益肾，明目固精之功。牡蛎咸，微寒，归肝、胆、肾经滋阴潜阳，全方配伍达滋补肝肾之功。在淋带早期叶天士以交通心肾，滋肾降心火为主。“诸液耗，必阴伤。”故在淋带后期的治疗以滋补肝肾为主。

4.3 治淋带基本组方的核心靶标及可能的作用途径中医治疗淋带有整体治疗的优势，中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，越来越多地被运用到淋带的治疗当中。

通过网络药理学方法预测叶天士治淋带基本组方的GO功能富集和KEGG信号通路，笔者发现，治淋带基本组方的生物功能主要集中在免疫炎症以及激素调节等方面。这与现代相关药理研究结果一致，如杨晓娜等[4]通过实验研究发现扶正祛湿中药可通过对血清和局部组织的炎症细胞因子以及粘连相关免疫分子的调节，有效缓解盆腔粘连，改善机体免疫功能。由于卵巢功能衰退，或卵巢手术史，雌激素水平下降，导致阴道黏膜萎缩、阴道上皮细胞内糖原减少，阴道pH值增高，局部抵抗力减弱，极易受细菌感染而引发老年性阴道炎症，同时多伴有泌尿系统的感染。中医学认为，老年性阴道炎的发生以肾虚为基础，因年老或刀刃创伤导致肾气不足，肝肾阴虚，易致化燥生风及湿热外邪侵袭而发病。王锦秀等[5]通过运用滋补肝肾中药治疗老年性阴道炎取得了良好效果，其可能通过提高女性的雌激素水平，提高阴道细胞的免疫力，增强阴道自净作用而发挥效应。

通过研究还发现，叶天士治疗淋带基本方可能通过吞噬小体信号通路、NOD样受体信号通路等免疫炎症相关通路发挥治疗作用。病原体入侵时，首先被吞噬细胞吞噬并形成吞噬小体，直接杀伤病原体，或者激活免疫反应，释放促炎细胞因子，发挥抗菌作用[6]。NOD样受体信号通路是细胞内重要信号传导通路，NOD样受体作为胞内模式识别受体是细菌感染的先天免疫传感器的识别器，通过抗原提呈激活机体的免疫炎症反应[7]。淋带的发病从现代医学的角度来看，多为细菌、真菌、支原体等病原体侵袭，造成泌尿生殖系统感染。此时，吞噬小体通路和NOD样受体信号通路被启动，其两者均可启动机体的免疫应答和炎症反应，提示在遣方用药的时候，可选择能够调控吞噬小体通路、NOD样受体信号通路关键蛋白的中药等[8]，发挥治疗淋带的作用。