东北刺人参不定根总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化活性的研究

吴晓晗， 范明智， 李学峰， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

东北刺人参(OplopanaxselatusNakai)，又称刺参或刺人参，为五加科刺参属多年生药用植物，主要分布于吉林省长白山区，俄罗斯、朝鲜也少有分布，是我国二级保护植物[1]。东北刺人参根较长且粗大，耐寒，但惧怕阳光直射，含有多种活性物质，主要包括黄酮类、总酚类、蒽醌类、多糖类、皂苷类、挥发油、不饱和脂肪酸和微量元素等[2-3]，具有抗真菌、抗氧化、预防肿瘤、抗衰老、镇痛、解热、补气助阳等功效[4-5]。

黄酮类物质作为植物体内的重要次生代谢产物之一，可作为一种天然的抗氧化剂进行开发利用，具有延缓衰老、防治疾病的作用[6]，其以纯天然，高活性，见效快等优点引起专家学者的广泛关注[7]。目前，大量关于东北刺人参的药理活性研究围绕着黄酮类物质展开。王广树等[8]试验从东北刺人参叶片中分离出黄酮苷，根据光谱测定结构，确定了山萘黄素等黄酮类化合物。陈红梅等[9]研究结果表明，黄酮类化合物具有较强清除自由基和抗氧化能力等的一类物质。曲淑岩等[10]通过用东北刺人参乙醇提取物对小鼠进行灌胃试验，结果表明小鼠的耐缺氧能力提高体内指标，发现有抗衰老的效果，从而证明东北刺人参具有抗衰老作用。而近年调查表明，天然东北刺人参已经寥寥无几，野生资源极度短缺[11]。在东北刺人参稀缺的情况下，生物反应器成为组培快繁的重要方式[12]，相比于其他培养方式而言，其具有生产成本较低，可周年生产，不受季节条件限制等优点，可为植物生长和代谢提供良好的环境，从而得到更多的生物量和代谢产物。目前李慧娟[13]已建立东北刺人参不定根反应器培养体系，而不定根总黄酮提取工艺的研究尚未见报道，因此，该试验以生物反应器培养的东北刺人参不定根为试验材料，在不同的提取溶剂、时间、温度、次数和料液比条件下，对东北刺人参不定根中总黄酮含量进行测定，并在单因素的试验基础上, 进行了四因素三水平正交试验, 从而优化东北刺人参不定根总黄酮的提取工艺。由于黄酮具有较强的抗氧化作用, 因此在东北刺人参不定根总黄酮的最佳提取工艺条件下采用DPPH、ABTS和铁离子螯合力等3种方法评价了在最佳条件下东北刺人参不定根提取物的抗氧化活性，旨在为东北刺人参不定根应用于化妆品相关产品的生产上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参照于丹[14]的试验方法，对东北刺人参不定根进行增殖。将增殖培养后的不定根切成约1 cm小段，称取不定根20 g(鲜重)将其接种于气球型气升式生物反应器内。培养基为MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L，pH值5.8。将反应器的通气量设置为75 mL/min，在25 ℃条件下进行暗培养，45 d后收获。将收获的不定根用水冲洗3次，沥干后放入烘干箱中进行干燥，烘干后的不定根干品即为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 不定根提取溶剂的筛选

精密称取东北刺人参不定根干品1 g，放置在烧瓶内，分别加入乙醇、甲醇、水，利用超声提取法，在50 ℃和40 kHz的频率下提取1 h后过滤。重复2次后合并滤液，利用旋转蒸发仪将滤液进行减压浓缩至膏状物，将浓缩的膏状物置于45 ℃的烘干箱中干燥直至恒重后进行总黄酮含量的测定。

1.2.2 不定根提取浓度的筛选

将东北刺人参不定根干品1 g浸泡在乙醇中,研究在不同乙醇浓度条件下东北刺人参不定根提取物对总黄酮含量的影响。按照1.2.1方法制备提取物,将乙醇浓度设置为25%、50%、75%和100%,测定不同浓度的提取物对总黄酮含量的影响,确定提取溶剂的最佳浓度。

1.2.3 不定根提取时间、次数、温度以及料液比的筛选

将不定根干品1 g置于50%的乙醇中，研究在不同提取时间、温度、次数以及料液比的条件下，提取工艺对不定根中总黄酮含量的影响。按照1.2.1方法提取不定根提取物，通过测定总黄酮含量，依次确定最适宜的提取工艺条件。

1) 提取时间试验：将提取时间设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h, 在50℃，料液比为1∶30 (g∶mL)的条件下，提取2次后对总黄酮含量进行测定，其他提取物提取方法同1.2.1；

2) 提取次数试验：以提取时间试验中不定根中黄酮含量最高的时间作为提取条件，将提取次数分别设置为1、2、3、4、5次后对总黄酮含量进行测定，其他提取物制备方法同1.2.1；

3) 提取温度试验：以提取次数试验中不定根中黄酮含量最高的次数作为提取条件，将提取温度设置为30、50、70、90 ℃后对总黄酮含量进行测定，其他提取物制备方法同1.2.1；

4) 料液比试验：以提取温度试验中不定根中总黄酮含量最高的温度为提取条件，将料液比设置为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g∶mL)后对总黄酮含量进行测定，其他提取物制备方法同1.2.1。

1.2.4 总黄酮提取工艺的优化

参照上述单因素试验结果，选不同提取时间、温度、次数以及料液比4个单因素，以东北刺人参不定根提取物中总黄酮的含量作为指标，设定4因素3水平L9(34)正交试验(表1)，确定最佳的提取工艺。然后根据正交试验中最佳提取工艺的条件，对其进行重复3次的验证试验，以此确定该条件是否具有稳定性。

表1 正交试验因素水平

1.2.5 总黄酮含量的测定方法

东北刺人参不定根不同溶剂提取物中总黄酮含量的测定方法参照Chang[15]的方法并稍加改动。精密称取10 mg芦丁标准品，用75%乙醇溶液定容至250 mL配制成浓度为40 μg/mL芦丁标准液。分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL芦丁标准液以及各样品待测液1.0 mL于试管中定容至2.0 mL。向每根试管中加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀静置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，充分摇匀6 min，最后加入4%的NaOH溶液2.0 mL。用紫外分光光度计(UV1102紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司，中国)在510 nm下测定吸光值OD，绘制标准曲线，计算出待测样品溶液浓度，总黄酮含量按下述公式计算。

总黄酮含量/mg·g-1=CVD/m

式中,C为待测样品溶液浓度;V为待测样品溶液体积;D为稀释倍数;m为干品质量

1.2.6 抗氧化活性的测定

1) 清除DPPH自由基活性测定 参照Noie[16]的方法对DPPH自由基清除能力进行测定。精密称取40 mg的提取物定容至20 mL，样品浓度为2.0 mg/mL，将上述溶液依次稀释至浓度为0.012 5、0.025、0.05 、0.1、0.2、0.4 、0.6、0.8和1 mg/mL的待测样品溶液，将抗坏血酸(VC，Sigma公司，美国)配置为等浓度溶液作为阳性对照。称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，索莱宝公司，中国)粉末0.003 9 g，用甲醇溶液定容至100 mL。向试管中加入2 mL待测样品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液，为待测样品组。空白对照组用2 mL甲醇代替待测样品。避光静置30 min后用紫外分光光度计在517 nm下测定吸光值OD，按照下述公式计算出DPPH自由基清除率。

式中，A空为空白对照组吸光值;A样为待测样品组吸光值。

2) 铁离子螯合能力测定 参照Fu等[17]的方法稍作改进，对东北刺人参不定根最佳提取溶液的铁离子螯合能力进行测定。称取100 mg的提取物溶于5 mL蒸馏水中，溶液浓度为20 mg/mL。将上述溶液依次稀释至浓度为0.625、1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/mL的待测样品溶液，将柠檬酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，中国)配制成等浓度溶液作为阳性对照。按照表2准确吸取待测样品溶液、蒸馏水、FeCl2(sigma公司，美国)溶液、菲洛嗪(sigma公司，美国)溶液于96孔板中，于室温中静置10 min。用酶标仪(iMark酶标仪，Bio-Rad，美国)在562 nm处测吸光值(OD)，并计算出铁离子螯合能力。

式中，A样为待测样品组吸光值，A对为对照组吸光值;A空为空白组吸光值。

表2 反应液的组成

3) 清除ABTS+自由基活性测定 参照Garzon等[18]的方法进行ABTS+清除试验，用去离子水配置2.45 mmol/L过硫酸钾(K2S2O8，麦克林公司，中国)和7 mmol/L的2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索莱宝公司，中国)混合溶液，室温避光静置16 h，配置成ABTS+储备液。试验前用去离子水将ABTS+储备液的吸光值稀释至在734 nm下为(0.700±0.02)。称取50 mg的提取物，溶于5 mL去离子水中，溶液浓度为10 mg/mL。将上述溶液依次稀释至浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10 mg/mL的待测样品溶液，将VC配置成等浓度溶液作为阳性对照。待测样品组取0.1 mL待测样品溶液和3.9 mL ABTS+溶液于试管中。取0.1 mL待测样品溶液和3.9 mL去离子水于试管中，而空白对照组向试管中加入0.1 mL甲醇溶液和3.9 mL ABTS+溶液。摇匀后静置6 min，用紫外分光光度计于734 nm下测得吸光值，按照下述公示计算出ABTS+清除率。

式中，A样为待测样品组吸光值；A对为待测样品对照组吸光值；A空为空白对照组吸光值。

1.2.7 软件分析及数据整理

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析试验数据，用邓肯氏新复极差法作对比，显著水平为0.05，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响

分别对不同溶剂提取的东北刺人参不定根提取物中总黄酮含量进行测定(图1)。

图1 不同提取溶剂对东北刺人参总黄酮含量的影响

不同溶剂间总黄酮含量存在显著性差异，黄酮含量依次为乙醇>甲醇>水。当提取溶剂为乙醇时，总黄酮的含量明显高于其他2种溶剂，达到99.28 mg/g(图1)。因此，将乙醇设置为该试验中东北刺人参不定根提取物的最佳提取溶剂。

2.2 不同提取浓度对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响

在探究提取溶剂浓度对东北刺人参不定根总黄酮含量的影响时，将乙醇浓度范围设置为25%～100%。结果发现，当乙醇浓度为50%时，东北刺人参不定根提取物总黄酮的含量达到最高，为101.12 mg/g(图2)。因此，在后续试验中选用50%的乙醇作为东北刺人参不定根提取的最适浓度。

图2 不同乙醇浓度对东北刺人参中总黄酮含量的影响

2.3 单因素试验

2.3.1 不同提取时间对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响

提取时间从0.5 h递加到2 h的过程中，总黄酮含量持续升高，当提取时间为2 h时，总黄酮含量达到最高，为119.87 mg/g(图3)，在2 h之后，总黄酮含量显著降低。因此，适宜的提取时间确定为2 h。

2.3.2 不同提取温度对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响

当提取温度从30 ℃递加至50 ℃时，总黄酮含量呈上升趋势，当提取温度为50 ℃时，总黄酮含量高达124.53 mg/g(图4)。但是当提取温度再次升高时，总黄酮含量开始缓慢降低。因此，适宜的提取温度确定为50 ℃。

图3 不同提取时间对东北刺人参中总黄酮含量的影响

图4 不同提取温度对东北刺人参中总黄酮含量的影响

2.3.3 不同提取次数对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响

不同提取次数对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响列于图5。

图5 不同提取次数对东北刺人参中总黄酮含量的影响

当提取次数从1次增加至2次时，总黄酮含量达到最高，为129.78 mg/g。在提取次数为3、4和5次时，总黄酮含量随着提取次数的增加显著下降(图5)。因此，选择的最佳提取次数为2次。

2.3.4 不同液料比对东北刺人参不定根中总黄酮含量的影响

在提取试验中，料液比是指提取物干重与溶剂体积之比。当料液比从1∶20(g∶mL)增加到1∶30 (g∶mL)时，总黄酮含量大幅升高，达到99.57 mg/g(图6)，但料液比超过1∶40(g∶mL)时，总黄酮含量依次降低。因此，适宜的料液比选定为1∶30(g∶mL)。

图6 不同提取料液比对东北刺人参中总黄酮含量的影响

2.4 提取工艺的优化

根据以上单因素试验结果，设定L9(34)正交试验方案，对提取时间(A)、提取温度(B)、提取次数(C)和料液比(D)4个因素进行不同组合，探究这些组合对总黄酮含量的影响，正交试验方案及结果见表3。

表3中的第4组,提取时间为2 h、提取温度为30 ℃、提取次数为2次、料液比为1∶40 (g∶mL)时，总黄酮含量最高，达到175.04 mg/g，高于其它组合。结果表明：R值由大到小依次为：料液比(D)>提取时间(A)>提取次数(C)>提取温度(B)。其中，影响最大的是料液比，其次是提取时间、提取次数和提取温度。分别计算出各因素水平对总黄酮含量的平均值K，经分析发现，提取时间(A)、提取温度(B)和提取次数(C)中K2值最大，料液比(D)中K3值最大，综上所述，最适宜的工艺条件为A2B2C2D3，即提取时间为2 h、提取温度为50 ℃、提取次数为2次、料液比为1∶30。

表3 正交试验方案及结果

为确定最优的提取工艺是否具有稳定性，对正交试验中得到最佳提取条件(A2B2C2D3)进行3次重复验证试验，结果发现总黄酮的平均含量为185.74 mg/g，高于正交试验中总黄酮的含量最高的第4组(175.04 mg/g)。验证试验结果的相对标准偏差(RSD)值较小，为0.6%，验证试验结果见表4。

表4 验证试验结果

2.5 抗氧化活性研究

在筛选出东北刺人参不定根总黄酮的最佳提取工艺后，试验进一步对不定根提取物的抗氧化活性进行研究(图7)。由图7-A可知, DPPH自由基清除能力随着提取物浓度升高而升高，在提取物浓度为1 mg/mL时，自由基清除率达到了95.56%。而图7-B表示的是不定根提取物对铁离子螯和能力的影响，当浓度为0～5 mg/mL时，铁离子螯和能力与提取物浓度呈正相关,在浓度达到20 mg/mL时，铁离子螯合能力达到最大值，为75.15%，显著高于阳性对照柠檬酸(60.12%)。从图7-C中可以明显看出，提取物清除ABTS自由基的能力，随着提取物浓度的提高， ABTS+清除率始终呈现上升趋势，当提取物浓度达到10 mg/mL 时，ABTS+清除率达到98.33%，稍低于阳性对照VC(100%)。

3 讨论与结论

近年来，由于对东北刺人参的大量采集,导致其野生资源逐渐稀少,直接影响了东北刺人参的研究与利用。而通过生物反应器可以大量培养植物细胞、组织或器官,目前已应用于金线莲[19]、高山红景天[20]等多种植物培养中。通过生物反应器培养的东北刺人参不定根具有抗炎、抗癌以及抗氧化等多种功效。其含有的黄酮类化合物具有很好的抗氧化效果，可以清除体内自由基，延缓衰老，减少癌症的发生, 成为保健品和化妆品的研发热点。

现如今,超声提取法被广泛应用于植物总黄酮的提取。姜守刚等[21]研究了野火球的提取工艺，其最优工艺参数为乙醇浓度50%,超声时间75 min,料液比1∶20 (g∶mL),超声功率350 W。在上述条件下,野火球总黄酮提取率为1.686%。牛明娟等[22]对泽漆黄酮的提取工艺进行优化，结果显示:

A ：DPPH自由基自由基清除能力，B：Fe3+螯和能力，C:ABTS+自由基清除能力。

乙醇浓度60%,料液比1∶25(g∶mL),超声时间1 h,并且测得黄酮的含量13.71 mg/g. 王飞等[23]对青扦针黄酮提取条件优化后的结果显示, 青扦针黄酮最佳的提取条件为超声温度64.88 ℃、时间49.46 min、超声功率319.63 W；此条件下,总黄酮提取率为4.118 69%。

该试验为了筛选东北刺人参不定根总黄酮最佳提取条件，采用超声提取法优化提取工艺，结果发现在乙醇浓度50%、提取温度50 ℃、提取2次、料液比1∶30 (g∶mL)条件下，总黄酮含量达到最高，为185.74 mg/g。在此条件下，试验利用体外抗氧化方法对东北刺人参不定根提取物的抗氧化能力进行评估。结果表明，东北刺人参具有较强的抗氧化活性，最佳条件下的不定根提取物对DPPH和ABTS均有清除能力，其中，对ABTS自由基清除率达到了98.33%。而随着提取物浓度的升高，铁离子螯和能力呈正相关，当达到一定浓度后，铁离子螯和能力达到平稳。综上所述, 东北刺人参不定根可作为抗氧化剂的一种较好的原材料，该研究对东北刺人参资源的开发及利用提供了良好的理论基础。