施氮时期对葡萄叶片光合生理及内源激素水平的影响

马宗桓，毛 娟，魏居灿，褚明宇，李文芳，周 琪，杨始锦，陈佰鸿

(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省白龙江林业管理局南华生态建设局，甘肃 张掖 734000)

氮肥和光合作用之间的关系已有许多研究[1-2]，为了保持作物的自然光合作用，>50%的氮被分配给光合器官[3]。氮素是果树生长发育最重要的矿质元素之一，能够影响果树生长中的各个环节，尤其是对果树光合生理的影响[4]。氮素能够影响果树叶片的气孔结构，改变叶片中的氮含量、叶绿素含量以及各种酶的活性[5]。合理施用氮肥可以提高叶片的光合效率，反之，则不利于叶片进行光合作用[6]。梁燕[7]的研究表明，富士幼苗在单株施入0～9 g的氮素水平范围内，植株叶片的光合指标随着氮素水平的升高而增加，之后随着氮素水平的提高反而下降。叶绿素荧光特性可以反映叶片光合系统对光能的吸收、传递、耗散和分配[8]。研究表明，氮素对叶绿素荧光特性有显著影响，施氮处理非光化学淬灭系数(NPQ)显著低于不施氮处理，增施氮素增大叶片PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)和叶片PSⅡ活性(Fv/Fo)，促使植物捕获光能和热耗散增加，光抑制减弱[9]。适宜的施氮量能显著促进叶片叶绿素的合成，提高光合速率、PSⅡ光化学最大效率和实际光化学效率[6]。人们在生产上主要通过合理施用氮肥来增强植物的光合生产性能。研究表明，改善作物光合生产率是提高产量和品质的生理基础[10-11]。

激素在影响植物生长发育时不是单一发挥作用，而是通过相互之间的协调平衡或是拮抗竞争来实现。植物可以正常开花结果，各种激素之间的比例必须达到某种协调或平衡才能实现[12-13]。例如细胞分裂素和生长素的比值对芽的分化和生长有着重要的调节作用，比值较高对花芽分化和生长作用明显[14]。氮素能够调节植物激素的生物合成，Kiba等[15]提出根际、根内氮状况信号以及地上部植株营养状况信号是通过细胞分裂素途径和生长素信号途径传导，二者的相互作用调控植物根系的生长发育与氮素吸收。苹果中研究发现，在整个生长期内叶片的ABA含量和淀粉在不施氮肥的情况下含量最高，而淀粉积累量与果树成花显著相关，不同氮水平下ABA合成差异也会造成树体光合产物的分配与贮藏形态的差异[16]。

目前，氮素在植物生长及光合生理方面的研究已经比较广泛，本研究主要在前期工作的基础上，探讨不同生育期施入氮素对葡萄叶片光合生理及内源激素水平的影响，以期为葡萄氮素合理施用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

田间试验于2016—2017年在武威市黄羊镇莫高葡萄酒原料基地进行，连续2 a按照试验设计进行水肥管理，并对叶片光合及荧光参数进行了测定，第2年试验进行内源激素水平的测定。试验基地土壤为中性到弱碱性的砾质沙壤土，土层深厚，透气好，年降雨量191 mm，蒸发量2 130.8 mm，年平均日照时数为2 724.8 h，≥10℃的有效积温在2 800℃～3 200℃，年平均温度6.9℃，气候凉爽，无霜期160 d，生长期光照充足，昼夜温差大。土壤有机质为6.2 g·kg-1，pH值7.8，速效氮0.9 g·kg-1，速效磷22 mg·kg-1，速效钾123 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验所用材料为10 a生酿酒葡萄‘蛇龙珠’，单篱架，树形为多主蔓扇形，株行距为1 m×3 m。每株葡萄留5个主蔓，在新梢生长至1 m左右时摘心，及时疏除果穗以下的副梢，顶端2个副梢留4叶摘心，其它副梢均单叶摘心。采用滴管灌溉，尿素随水施入，葡萄植株两侧开沟分别施入过磷酸钙750 kg·hm-2，硫酸钾825 kg·hm-2，过磷酸钙在出土后第1次灌水前施入，硫酸钾在果实转色期施入。滴灌带为酒泉大禹节水有限公司生产，壁厚0.2 mm，滴孔间距30 cm，单孔出水量3 L·h-1，灌水量及时间参照“武威莫高酿造葡萄滴灌配水定额表[11]”进行，在试验中根据实际情况有所调整。试验共设置21个小区，每小区为一个处理，设置3个生物学重复，各处理随机分布。小区长80 m，宽60 m，面积为240 m2，每个小区定植40株葡萄，取样时不在同一棵葡萄树上重复取样。‘蛇龙珠’葡萄在该地区的主要生育期见表1。

不同生育期施入等量氮肥，氮素分别在萌芽前(S1，4月25日)、新梢旺长期(S2，5月15日)、开花期(S3，6月5日)、果实第一次膨大期(S4，6月25日)和副梢生长旺期(S5，7月20日)一次性施入300 kg·hm-2尿素。为对照整个生育期均不施氮肥(CK)。分别于7月25日(花后50 d，DAF50)、8月29日(花后85 d，DAF85)和10月3日(花后120 d，DAF120)进行各项指标的测定并取样。光合及荧光相关参数于晴天上午9∶00～11∶00进行，测定时每个处理选取新梢从基部向上第4～5节位叶30片，测定SPAD值及光合荧光相关参数，然后摘除叶片，去除叶脉后称取5 g在液氮中速冻后置于超低温冰箱保存，每处理设置3个生物学重复，取样时在同一植株上不重复取样。

表1 ‘蛇龙珠’葡萄在武威地区的主要生育期

1.2 测定项目与方法

1.2.1 叶绿素含量及光合荧光参数测定 叶绿素相对含量使用SPAD502叶绿素仪进行测定。净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)使用便携式光合系统(CIRAS-2, PP-system, UK)进行测定。测定时相对湿度保持在75%，空气CO2浓度为380 mol ·mol-1，叶片温度保持在25℃，光量子通量密度调整为1 000 mol·m-2·s-1。叶片荧光参数用便携脉冲调制式荧光仪(FMS-2, Hansatech, UK)测定。

1.2.2 内源激素的提取 将冷冻的叶片在液氮中快速研磨成粉末，用10 mL 80%的色谱甲醇(超纯水配制)分3次洗入15 mL离心管中，放4℃冰箱中浸提24 h，期间每隔1 h震荡混匀1次，1 000 r·min-1离心15 min。吸取上清液用旋转蒸发仪在40℃下浓缩除去甲醇，得到约2 mL的浓缩液，用50%的甲醇冲洗蒸发瓶瓶壁，最后定容至10 mL，用一次性针管吸取2 mL过0.22 μm有机膜，装入1.5 mL的离心管放入冰盒中避光保存，测定玉米素(ZT)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)含量。赤霉素(GA3)的浸提液为乙腈，提取步骤与前面一致。

1.2.3 内源激素的测定 液相色谱仪型号为Agilent 1100 series，检测器为vwd，色谱柱为Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为色谱甲醇和超声后0.6%的冰乙酸(0 min，甲醇∶乙酸=40∶60；11.9 min，甲醇∶乙酸=40∶60；12 min，甲醇∶乙酸=50∶50)，流速为1.0 mL·min-1，波长为254 nm，柱温25℃。进样量为10 μL，标样均为美国Sigma产品，取各浓度的混标溶液进行液相色谱分析后绘制标准曲线。采用外标法进行样内源激素含量的确定。

1.3 数据分析

用Microsaft Excel软件进行数据整理，用SPSS 19.0对数据进行统计分析，采用Duncan法进行方差分析，Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 施氮时期对葡萄叶片光合作用的影响

与对照相比，不同时期施氮肥均显著增加了叶片Tr水平(表2)，S2处理叶片Tr在3个时期均最高。S1处理除2017年在DAF50时叶片Tr与S2无显著差异外，其他生育期S1处理Tr均显著低于S2，在DAF85时，S3处理叶片Tr与S2无显著差异。S4处理叶片Tr均显著高于CK，在DAF50和DAF120时，S5和CK叶片Tr无显著差异，DAF85时，S5显著高于CK。

从表3测定结果来看，S2处理叶片Gs增加最为显著，除S3处理在2016年DAF85时Gs与S2处理无显著差异外，其余各生育期Gs均显著高于其他处理。S1和S3处理各个生育期Gs无显著差异。相比其他处理，S5处理在各生育期Gs较小，在DAF50和DAF85时S5处理与对照无显著差异，DAF120时显著高于对照。

由表4可知，施氮处理降低了叶片Ci，2016、2017年中CK和S1处理叶片Ci均最高。DAF50和DAF85时，2016年和2017年S1、S2和S5处理间Ci无显著差异，同样，2016年的DAF120时，S1、S2和S5处理间Ci无显著差异，而2017年S1处理Gi显著高于S2和S5。S3和S4处理在2 a中叶片发育的各时期Gi均无显著差异。

由表5可以看出，叶片Pn在DAF85达到了最高，并且在DAF120时下降。不同时期施氮均增加了各生育期叶片Pn，CK叶片Pn最小。S1、S2和S3处理对各生育期叶片Pn的增加较为显著，S2和S3处理在2016和2017年各生育期Pn差异均不显著。

表2 施氮时期对不同生育期葡萄叶片蒸腾速率(Tr)的影响/(mmol·m-2·s-1)

表3 施氮时期对不同生育期葡萄叶片气孔导度(Gs)的影响/(mol·m-2·s-1)

表4 施氮时期对不同生育期葡萄叶片胞间CO2浓度(Ci)的影响/(μmol·mol-1)

表5 施氮时期对不同生育期葡萄叶片净光合速率(Pn)的影响/(μmol·m-2·s-1)

2.2 施氮时期对葡萄叶片叶绿素荧光参数的影响

由表6可知，不同时期施氮提高了叶片ФPSⅡ，S1、S2和S3处理ФPSⅡ显著高于S4、S5处理及CK，可见，生育前期施氮有利于叶片ФPSⅡ的增大。S1和S2处理，S4和S5处理的ФPSⅡ分别在2016年和2017年的各生育期均无显著差异，S2处理在2016年的DAF50和DAF120时显著高于S3处理，其他时期两个处理间无显著差异。CK的ФPSⅡ最低，在DAF50时与S5处理无显著差异，而在DAF120时显著低于S5处理。

S1、S2和S3处理叶片Fv/Fm在各生育期均无显著差异(表7)，可见，这3个时期施氮肥对Fv/Fm的影响较小。CK叶片Fv/Fm值显著小于各施氮处理，不施氮肥显著降低Fv/Fm。S4和S5处理Fv/Fm在2016年差异显著，而在2017年两个处理间差异不显著。

由表8可知,2016年和2017年，S2处理在各生育期qP均最高，S1和S3处理在DAF50和DAF85时qP无显著差异，2016年S1处理qP显著高于S3，而2017年二者无显著差异。DAF50时S4和S5处理间qP无显著差异，且均显著高于CK，DAF85和DAF120时除S5处理在2016年qP与对照无显著差异外，其他各处理均显著高于CK。

S1～S5处理中,随施氮时期的后移NPQ增大，S5和CK间NPQ无显著差异，在各生育期NPQ均较高，S4除2017年的DAF85时显著低于CK外，其他均与S5和对照无显著差异(表9)。DAF50时，S3处理NPQ显著高于S1和S2；DAF85时，2016年S2和S3处理NPQ无显著差异，而S3显著高于S1，2017年S1、S2和S3处理均无显著差异；DAF120时，连续两年测得NPQ在S1、S2和S3处理之间无显著差异。

2.3 施氮时期对葡萄叶片内源激素含量的影响

不同时期施氮对葡萄叶片ZT含量的影响如图1A，不同时期施氮对不同生育期叶片内源激素水平的影响不同。DAF50时S4处理叶片中ZT含量显著高于其他各处理，S3、S4和S5叶片ZT含量显著高于对照，分别是对照的1.27倍、1.46倍和1.10倍。DAF85时，S1叶片中ZT含量显著高于对照，是对照的1.6倍，S3和S4处理叶片中ZT含量无显著差异，均显著高于对照，S5处理和对照差异不显著。DAF120时，与对照相比，各施氮处理促进了叶片中ZT的积累，S1、S2和S5处理对叶片中ZT含量的增加效果最为显著，分别是对照的1.57倍、1.52倍和1.58倍，且3个处理间无显著差异，S3和S4间无显著差异，但均显著高于对照。

表6 施氮时期对不同生育期葡萄叶片ФPSⅡ的影响

表7 施氮时期对不同生育期葡萄叶片Fv/Fm的影响

表8 施氮时期对不同生育期葡萄叶片qP的影响

与DAF50时相比，在DAF85和DAF120时叶片IAA含量升高(图1B)，DAF50时，S4叶片中IAA含量最高，为27.38 μg·g-1，显著高于其他处理。S1、S2和S3处理叶片IAA含量均显著低于对照，S5处理和对照无显著差异。DAF85时，S1、S2、S3、S4和S5处理叶片IAA含量均显著高于对照，S2处理IAA含量最高，为34.70 μg·g-1，S1、S3、S4和S5处理叶片中IAA含量无显著差异。DAF120时，S1和S2处理叶片IAA含量和对照无显著差异，均显著低于S3、S4处理和S5处理，S3、S4处理和S5处理显著促进了叶片中IAA含量的积累，在该生育期IAA含量均显著高于对照，分别为35.41、35.60 μg·g-1和36.99 μg·g-1(图1B)。

DAF50时，S1、S2、S3、S4和S5处理叶片ABA含量显著高于对照，S1、S2、S3和S4处理间无显著差异，但均显著高于S5处理。DAF85时，S1、S2和S4处理叶片中ABA含量分别为6.25、6.33 μg·g-1和5.39 μg·g-1，显著低于对照及其他施氮处理，S3和S5处理叶片中ABA含量与对照无显著差异。DAF120时，对照叶片中ABA含量显著高于各施氮处理，S1、S4和S5处理叶片ABA含量无显著差异，S3处理叶片ABA含量为5.74 μg·g-1，显著低于对照和各施氮处理(图1C)。

由图1D可知，葡萄叶片中GA3含量随叶片发育逐渐减少，DAF50时，施氮处理叶片GA3含量显著高于CK，S3、S4和S5处理叶片GA3含量无显著差异，分别是对照的2.16倍、2.25倍和2.17倍。DAF85时，各施氮处理均显著增加了叶片中GA3的含量，S1、S2、S3、S4和S5处理叶片中GA3含量分别为7.05、8.2、8.44、8.82 μg·g-1和7.82 μg·g-1，其中S4处理叶片中GA3含量最高，是对照的2.71倍。DAF120时，叶片中GA3含量下降，施氮处理叶片中GA3含量显著高于对照，其中，S1、S2和S3处理在该生育期GA3含量无显著差异，S4处理叶片中GA3含量最高，是该时期对照的1.63倍。

表9 施氮时期对不同生育期葡萄叶片NPQ的影响

注：不同小写字母表示处理之间差异显著(P<0.05)。Note: The different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05)．图1 施氮时期对葡萄叶片内源激素水平的影响Fig.1 Effects of nitrogen application timing on endogenous hormone levels in grape leaves

3 讨 论

植物主要通过光合作用积累干物质，光合作用可直接影响植物的生长、产量和品质形成。影响光合作用的因子很多，比如光照、水分、CO2浓度、温度和矿质元素等[17-19]。在农业生产中，影响植株生长和干物质积累的因素还有土壤水分和氮素，不同的土壤水分含量和氮素水平影响植物的光合能力，从而直接影响植株的生产能力[20]。研究发现在一定范围内随着施氮量的增加叶片净光合速率显著提高[17]。另外，研究发现适当推迟施氮时期有利于提高叶片净光合速率，延缓叶片衰老，延长光合时间[21]。本研究发现，不同时期施氮均能增加叶片净光合速率，在花前施氮肥效果最为显著，能够显著延长光合时间。同时，在副梢生长旺期前施氮肥叶片Gs和Tr也显著高于对照，Ci与之相反。研究表明，氮素有利于叶片Gs的增加，主要是由于氮素通过调控植物对钾元素的吸收增加所致，空气动力学研究结果认为钾素能够调节气孔的开张[8]。茶树中的研究结果表明，施氮通过增加叶片的Pn、Gs和Tr，降低Ci以促进茶树的生长[6]，本研究的结果与之相同。从本研究中新梢旺长期和开花期施氮肥Pn、Gs和Tr相对高于其他各生育期施氮，因此，认为这两个生育期施氮能够改善葡萄叶片光合性能，增加光合同化能力。

与表观的光合指标相比，叶绿素荧光特性能够反映植物叶片光系统对光能的吸收、传递、耗散和分配，通过叶片的荧光特性可以分析植物生长状况及生理状态[22]。研究表明，施氮量的提高会增加叶片的qP，而显著降低NPQ[23]。Fv/Fm代表了PSⅡ的最大光化学效率，能反映植物对光能的利用效率，本研究中，施氮增加了叶片的ФPSⅡ、Fv/Fm和qP，而NPQ相反，可见氮素改变了叶片荧光参数，从而促进叶片的光合作用。果实第一次膨大期之前施入氮肥对叶片ФPSⅡ和qP的增加最显著，副梢生长期施氮肥和对照的NPQ在各生育期最高。萌芽期、新梢旺长期和开花期施氮肥对葡萄各生育期ФPSⅡ、Fv/Fm和qP的增加显著，从而增加叶片的光合同化能力。

施氮时期可通过影响植物体内的内源激素水平变化而对植物的生长发育起作用。研究表明，氮素可以调节植物根系形态生理及构型，进而影响植物地上部分的生长发育和养分吸收及利用[24]。研究表明，施氮量增加会增加植株体内促进型激素含量，但ZT/GA和ABA/GA比值逐渐减低，氮肥利用率显著降低[25]。氮肥和钾肥供应充足时有利于植物根系和地上部分的生长，细胞分裂素合成增加，ABA分解加快，延缓植物衰老，当植物缺素或者养分不足时则相反[26]。本研究发现氮素施用时期不同，葡萄不同生育期叶片的内源激素水平不同，和不施氮肥相比，DAF85后施氮肥均显著提高了叶片ZT含量。花后施入氮素叶片IAA含量在果实采收时保持较高的水平，在果实第一次膨大期和新梢旺长期施氮肥GA3含量最高。可见，施入氮素会促使促进生长型激素含量的增加，施氮时期延后，对采收后叶片功能保持具有积极作用。施入氮素降低了采收时葡萄叶片的ABA含量，新梢旺长期和花期施氮对ABA含量减少最为显著。因此，施氮也减少了葡萄生育后期抑制生长型激素含量，从而延长叶片光合同化时间。本研究中发现，在DAF50时，施氮处理叶片中ABA含量显著高于对照叶片ABA含量，而在果实采收时对照处理与施氮处理相比，叶片ABA含量显著升高。有研究表明，ABA能够促进植株保卫细胞的气孔关闭以维持植株内的水分[27]，在DAF50时，河西走廊地区气温达到全年最高的时段，氮素促进叶片ABA含量增加可能与叶片水分保持有关。

4 结 论

本试验主要研究不同生育期施入氮素对酿酒葡萄叶片光合及荧光特性、内源激素水平的影响，与CK相比，新梢旺长期和开花期施氮叶片Tr、Gs和Pn分别提高4.3%、2.1%和9.3%以上，Ci显著降低；萌芽期、新梢旺长期和开花期施氮肥叶片ФPSⅡ、Fv/Fm和qP与CK相比增加量在1.5%～11.7%之间，NPQ降低；同时，不同生育期施氮肥有利于促进生长型激素的积累，而降低采收期叶片ABA的增加。