黄芪多糖对食管癌组织中炎症因子表达的影响及与p-AKT-AKT-VEGF信号通路的关系*

孙小虎, 王璐, 刘春娜, 张文陆△

1锦州医科大学附属第一医院肿瘤科(辽宁锦州 121001)； 2辽宁省肿瘤医院病理科(辽宁沈阳 110042)

近年来，消化系统肿瘤越来越常见，其中食管癌(EPC)作为常见的消化道肿瘤之一，呈现上升趋势并且患病人群趋于年轻化[1]。EPC的早期诊断、早期治疗对EPC患者的预后至关重要。目前，手术切除疗法、放射治疗和化学药物治疗方法是EPC的主要治疗手段，但仍有部分患者出现手术后的复发或并发症，而且很多化疗药物治疗过程中，有多种不良反应，甚至患者不能耐受其严重的不良反应，而放弃治疗[2]。由于以上治疗EPC中的诸多不足之处，因此，寻找安全有效的EPC的治疗手段，已经成为急需解决的主要问题。为补充EPC治疗中的不足，综合治疗手段已是治疗EPC常用而有效的治疗方法。新近的研究发现，传统中药黄芪(Astragalus，AGs)的有效成分黄芪多糖(APS)在EPC的综合治疗中发挥重要的作用，特别是减少术后并发症作用尤为显著。研究表明，一些炎症因子及炎症细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、髓系细胞触发受体(TREM-1)和表皮生长因子受体(EGFR)可能激活下游信号通路，触发后续的病理生理学效应，参与多种肿瘤发生和发展，如EPC、结肠癌等，并可能影响肿瘤的转移及预后[3-4]。但APS对EPC治疗作用，特别是对炎症因子是如何影响，以及在治疗EPC中的可能信号机制，目前仍少见报道。为了更好地研究EPC的早期诊断及综合治疗，本研究采用ELISA方法测定多种炎症因子的含量变化，另采用Western blot方法定量检测TREM-1及EGFR在EPC及癌旁组织中的表达，并检测AKT、p-AKT，以探讨APS糖对EPC保护作用新的信号通路机制。为EPC的早期诊断提供依据，如检测TREM-1和EGFR，可为EPC的早期检出率提供实验室指标，为EPC的治疗提供新的有效辅助治疗方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年12月来院就诊的EPC患者20例为单纯手术治疗组(EPC组)；另选取EPC患者20例，手术前7 d，征得患者同意给予APS治疗，为药物治疗组(APS组)。同时选取其相应癌旁组织(EPC边缘外≥5 cm)共20例作为空白对照组(TAEC组)。上述入组的EPC患者，均签署知情同意书。上述所有的受试病例均无重复，且各受试临床病理资料均完整。各组患者的一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。见表1。

表1 各组EPC患者临床资料比较 例

1.2 试验药品 黄芪多糖注射液(250 mg/支，天津赛诺制药有限公司生产)；白细胞介素(IL)-12、IL-6及VEGF测定试剂盒(碧云天生物公司)，TREM-1抗人单克隆抗体(ab214202，英国Abcam公司)；兔抗人AKT、p-AKT单克隆抗体(Cell Signal Technology 公司)。

1.3 给药及标本处理 APS治疗组患者术前征得患者同意后，每天给予APS(1 mg/ kg)药物治疗，给药时程为7 d。7 d后进行手术切除治疗。EPC组未给以APS辅助治疗，采用单纯手术治疗。手术后收集上述各受试组中EPC组织进行病理观察，离体30 min内进行处理。具体操作方法：在上述患者手术肿瘤食管部位，切取面积约1.0 cm×1.0 cm的食管组织作为受试组织。取出的食管组织即用生理盐水(NS)进行漂洗，备用。

1.4 试验方法

1.4.1 观察术后一般状态 APS治疗给药期间及手术切除后，记录各组受试EPC患者行为活动，精神状态等，并观察术后是否出现并发症(如术后胃肠道反应、出血等)。

1.4.2 炎症及细胞因子的测定 各组EPC患者手术结束后，按照上述食管标本取材要求，选取肿瘤及肿瘤旁组织，取各组受试食管组织的匀浆，采用ELISA 法测定炎症因子的含量变化，包括测定IL-12、IL-6及VEGF的含量，以及TREM-1及EGFR的含量变化。

1.4.3 SP免疫组化炎症因子的测定 另取一部分EPC组织经过脱蜡、梯度酒精脱水、抗原修复后滴加一抗和二抗，经DAB显色和苏木素复染后，在400倍光镜下，随机选取10个视野，根据细胞染色部位，进行染色密度和染色强度结果评分。判定Trem-1和EGFR结果评分标准为，>2分者为染色阳性，≤2分者为染色阴性。具体的评分标准如下：染色面积评估：0分：无阳性染色细胞；1分：≤25%；2分：26%～50%；3分：51%～100%。染色强度评分：0分：阳性细胞无着色；1分：阳性细胞淡黄色；2 分：呈现染色特性为棕黄色；3分：棕褐色。细胞膜(CM)评分：0分<10% CM染色；1分：≥10% CM微弱染色；2分：≥10%侧膜、基底侧膜中度染色；3分：≥10%细胞强染色出现在侧膜、基底膜。上述评分之和用来判断TREM-1和EGFR 染色结果。

1.4.4 采用Western blot方法测定各组受试结肠组织中AKT和p-AKT的蛋白表达 实验中各受试组中分别加入AKT、p-AKT、β-actin。采用 ECL试剂法进行显色，应用Image Quant LAS 4000凝胶成像系统获得扫描图像，根据Image J软件分析条带灰度值，并与内参比较，用以计算AKT、p-AKT的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组术后一般状况 EPC组及TAEC组中患者术后有40%的患者出现手术并发症，如消化道症状、伤口出血、伤口愈合延迟等。APS组上述症状明显改善，各患者术后未见切口部位出血、感染和预后延迟，APS组中EPC患者的一般状态有缓解，较EPC组近期并发症明显降低，见表2。

表2 各组手术后2周内并发症发生率的比较 例(%)

2.2 IL-12及IL-6的炎症因子及VEGF含量测定 与TAEC组相比，EPC组受试患者食管组织中，炎症因子IL-6 及IL-12明显升高，炎症细胞因子VEGF也升高(P<0.01)，而术前7 d应用APS的食管癌患者，上述炎症因子及炎症细胞因子结果显著下降，与EPC组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组手术后IL-12、IL-6和VEGF的比较

2.3 TREM-1及EGFR的炎症细胞因子含量测定 EPC组的食管组织中，细胞因子TREM-1及EGFR明显升高，EPC组及APS组与TAEC组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。另外，术后APS组与EPC组相比，上述炎症性胞因子结果显著下降(P<0.05);APS组与EPC组相比，上述炎症细胞因子也均显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 各组手术后TREM-1和EGFR的比较

2.4 TREM-1及EGFR在EPC及癌旁组织中表达 SP免疫组化结果显示，在TAEC组的癌旁组织中TREM-1主要表达于细胞膜，其阳性表达率降低，EPC组和APS组食管癌组织中表达均升高，与TAEC组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。在EPC组的EPC组织中，TREM-1及EGFR阳性定位于细胞核及细胞浆内，阳性表达常见，每张切片取十个视野，阳性表达率明显升高。在APS组中，TREM-1阳性染色也可见，阳性表达率也升高，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。与TAEC组的癌旁组织中相比，EPC组和APS组EPC组织中的EGFR的表达也明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。在EPC组的EPC组织中，EGFR阳性率高于APS给药组，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1～2、表5。

注：A：EPC组；B：APS组；C：TAEC组

注：A：EPC组；B：APS组；C：TAEC组

表5 各组手术后炎症因子的阳性表达率比较 %

2.5 食管肿瘤组织中AKT和p-AKT的蛋白表达 与TAEC组相比，APS组和EPC组食管肿瘤组织中的PKB蛋白表达量明显升高，而p-AKT含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与EPC组相比，APS组及TAEC组AKT蛋白表达量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6及图3。

表6 各组手术后食管组织中AKT、p-AKT的影响(OD值)

图3 各组中AKT及p-AKT蛋白表达的影响

3 讨论

EPC是较为常见的消化道肿瘤，其发病率逐年升高且趋于年轻化。目前，EPC仍以手术治疗作为最有效的治疗手段，但单纯的手术治疗并非最有效手段，其术后仍有可能出现诸多并发症甚至导致EPC复发。因此，手术结合药物治疗的综合疗法突显出重要性，其中传统中药的辅助治疗同时结合手术治疗，已成为治疗EPC的新的最佳手段[1-2]。

新近的研究报道表明，传统中药黄芪的有效成分APS在EPC的综合治疗中发挥重要的辅助治疗作用，特别是在减少EPC术后并发症作用尤为显著。APS具有良好的抗氧化、抗缺血、抗肿瘤及提高机能免疫能力等多重药理作用。APS是研究较早的多糖类，新近的研究发现可用于减轻肿瘤手术后、放疗以及化疗期间引起的不良反应，可以作为肿瘤治疗的辅助用药，特别是用于消化道肿瘤，如EPC的辅助治疗[5-6]。

IL-12 及IL-6是存在于多种组织和细胞内的较为常见的炎症因子，两者参与并诱发了多种炎症反应，并可能触发了随后的免疫炎症反应。另外VEGF也证实诱导多种疾病(包括肿瘤)的发生与发展，如EPC、结肠癌等[7-8]。在本研究中，应用APS的EPC术后患者，一般状态良好，术后并发症减轻。提示APS对EPC术后有一定辅助治疗作用。IL-12 及IL-6是炎症细胞在应激反应的免疫应答中产生的生物活性的炎症因子，药物能降低IL-12 及IL-6则能抑制炎症反应。本研究结果表明，APS能明显降低炎症因子IL-12、IL-6及VEGF的含量，提示APS能通过降低IL-12、IL-6及VEGF的含量，降低EPC术后的炎症反应，并进一步说明了APS是通过减少局部炎症因子减轻手术切口局部的炎症反应，促进伤口愈合，降低并发症。

TREM-1是2000年才发现并证实的一种新型炎症效应及细胞调控因子[9-10]。TREM-1选择性表达于中性粒细胞(neutrophils)和CD14炎症单核细胞，参与急性炎症反应，在正常的消化道组织中存在弱的阳性表达。表皮生长因子受体，EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体(transmembrane tyrosine kinase receptor)，是原癌基因c-erbB1的表达产物之一，研究已经证实其参与了多种肿瘤细胞的增殖及生长过程[11-12]。在本研究中，率先证明了APS能明显降低炎症细胞因子TREM-1和EGFR含量及阳性表达，该结果提示APS在EPC的辅助治疗中可能通过降低TREM-1和EGFR含量，发挥其对EPC的治疗及预防作用。新近的研究表明，多种炎症反应可能上调TREM-1在炎症细胞表面促进可溶性亚型——sTREM-1的胞外分泌及表达[9,13]。本研究中APS不仅能降低炎症细胞因子TREM-1和EGFR的含量，而且能降低TREM-1和EGFR在食管组织中的阳性表达，该实验结果提示了APS对EPC的治疗及预防作用是通过降低炎症细胞因子实现的，也提示APS可能作为一种酪氨酸激酶抑制剂发挥其对EPC及相关消化道肿瘤的辅助治疗作用。本研究率先阐明了TREM-1和EGFR的表达及含量测定可以用于EPC的早期诊断，将提高EPC的早期检出率，并能提高患者的治愈率，降低患者的复发率。

pAKT-AKT信号通路在多种肿瘤的发生发展中出现异常活化， AKT信号通路对于肿瘤细胞增殖、生长及凋亡中至关重要，该信号通路对蛋白质和葡萄糖代谢也发挥重要作用[14]。在本研究Western blot的结果中发现，APS能减低食管肿瘤组织中的AKT蛋白表达水平，升高p-AKT水平。AKT是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，多项研究已证实了AKT参与多种生理以及病理活动[15]，本研究的这部分结果提示，APS可能是通过下调p-AKT-AKT信号途径，进而下调多种炎症介质及炎症细胞因子的表达，在EPC，乃至多种消化道疾病中发挥治疗及预防的作用。

综上所述，APS对EPC的防治作用可能是影响p-PKA-PKA信号途径，调节下游的多种炎症因子(如TREM-1、EGFR、IL-12、IL-6及VEGF)，TREM-1和EGFR的表达及含量测定可以用于EPC的早期诊断，APS将成为治疗与预防EPC的新的药物作用靶点，因此对APS机制的深入研究，将有可能为以后肿瘤的研究、治疗提供新的思路和方法。