乌司他丁对羊水栓塞大鼠肺部损伤的影响及机制

李萍, 洪珍平

天津市津南医院 1妇产科， 2内科(天津 300350)

羊水栓塞(amniotic fluid embolism，AFE)为分娩过程中出现的羊水突然进入母体血液循环所引起的一种罕见的、难以预测的危重的临床综合征，其主要以急性肺栓塞、过敏性休克、严重时猝死等严重的分娩期并发症，对母婴安全有着严重威胁，当被胎粪污染的羊水进入到母体血液后，其在反应过程中将补体及中心粒细胞激活后即可导致炎症反应，引起肺部血管内皮细胞受损，细胞的通透性升高使细胞的渗出液增多，引起肺水肿，从而导致患者出现呼吸困难，低氧血症甚至是呼吸衰竭[1-2]。乌司他丁(UTI)目前已广泛应用于多种危重疾病的治疗，其对各种原因所致的急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征均有显著的疗效[3-4]，但是乌司他丁对于羊水栓塞所致的肺损伤的治疗效果和机制未见相关报道。2019年3月15日至8月21日,本研究拟构建羊水栓塞肺部损伤大鼠模型后，予以乌司他丁干预，探讨乌司他丁对羊水栓塞所致肺损伤的保护作用及可能机制，为临床有效治疗羊水栓塞提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及材料 雌性SD孕鼠60只，胎龄20 d，体重270～390 g，由南开大学动物实验中心提供[动物质量合格证号：SCXK(津)20120024，SYXK(津)2014-0083]；乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司，国药准字H19990133)；基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、GAPDH单克隆抗体(Sigma公司，美国)Trizol试剂盒、IP细胞裂解液、ELISA相关试剂盒、Western blot试剂盒(碧云天生物技术研究所)；相关引物合成(北京赛百胜生物技术公司)；普通光学倒置显微镜(Nikon)。

1.2 动物造摸及分组 取妊娠晚期(孕19～20 d)SD 雌鼠60 只，自由饮水，禁食12 h后按0.35 mg/100 g剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉满意后,将大鼠仰卧固定,腹部中线备皮，经75%的酒精消毒后, 腹正中行3 cm切口,暴露子宫, 取胎鼠后行子宫次切术后关腹。1 mL 注射器抽取羊水后注入到胎鼠肠腔内，将胎粪冲洗出来，生理盐水配置 1% 的羊水胎粪液备用。实验分为3组，每组20只: 对照组经股静脉注入生理盐水；羊水栓塞组：股静脉按0.25 mL/100 g 注入羊水胎粪液后腹腔注射等体积的生理盐水；乌司他丁组：股静脉按0.25 mL/100 g 注入羊水胎粪液后腹腔注射乌司他丁10×104U/kg，8 h后进行后继检测。若实验中大鼠死亡, 则重新造摸后增补。

1.3 炎症因子ELISA测定 每组随机选5只大鼠予10% KCl处死后，打开胸腔，分离气管，用手术刀在气管上行“T”形切口，经切口向气管内置入适当长度的静脉导管，通过注射器吸取适量无菌生理盐水，经静脉导管注入肺中反复冲洗，经3次冲洗后将抽出的液体置入到2 mL 的EP管内，采用ELISA法检测肺泡灌洗液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10、IL-1β及IL-6因子含量。具体操作步骤照各种ELISA试剂说明书进行操作。

1.4 肺组织病理改变 每组随机选5只大鼠10% KCl处死大鼠后，打开胸腔，将双侧肺组织取出，并放于事先准备好的容器中，容器中盛有10%甲醛，将肺组织进行固定24 h后，取出肺组织用石蜡进行包埋，经过特定时间的包埋后，将肺组织进行切片处理，切片厚度应均匀，然后将各组切片均进行HE染色，将染色后的切片再经过树胶封固及烤干后，置于光镜下进行观察肺组织结构的改变。

1.5 光镜分析小鼠肺组织湿干比变化 每组随机选5只大鼠予10% KCl处死后，打开胸腔，将双侧肺组织取出，置于备好的锡箔纸上，锡箔纸已经测定重量且设定为W0，将肺组织与锡箔纸一起再次测定重量设为W1，W1-W0为大鼠肺组织的湿重，同法对各只大鼠肺组织湿重测定并记录，打开烘干箱，将各组大鼠肺组织均置入其中进行烘干，烘干条件为70℃，时长为72 h，烘干后取出对烘干的肺组织与锡箔纸再次称重，重量设定为W2，W2-W0为大鼠肺组织干重，称量完毕后，W/D值=(W1-W0)/(W2-W0)。

1.6 RT-PCR检测 每组随机选5只大鼠予10% KCl 处死后，打开胸腔，将双侧肺组织取出，取50 mg于液氮中研碎，加入TRIzol试剂裂解细胞提取总RNA。根据逆转录说明书合成相应的cDNA并进行扩增。反应条件：95℃预变性2 min，95℃退火15 s，54℃ 30 s，65℃ 20 s，扩增40循环，最终72℃延伸7 min。MMP-2引物序列上游:5′-TTTTTGTGCCCAAAGAAAGG-3′,下游：5′- ATGTCAGACAACCCGAGTCC-3′;扩增长度为414 bp; MMP-9引物序列上游：5′- GGTTTCTGTCCAGACCAAGG-3′，下游：5′- TGCAAGGATTGTCATCTGGA-3′;扩增长度为379 bp；参照物GAPDH引物序列上游：5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′；下游：5′-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′，扩增长度为190 bp。以GAPDH为内参，测定MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达水平。

1.7 Western blot检测 将RT-PCR提取后剩余物以1 500 r/min，离心30 min，取上清为粗体蛋白质，通过BCA法测定各组蛋白含量，5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V，3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37℃摇床封闭2 h，转印后加入MMP-2、MMP-9及GAPDH一抗(1∶1 000)孵育过夜，二抗(1∶1 500)室温孵育1 h，暗室加入ECL发光液后曝光后显影，X线胶片照相，行灰度值分析。

2 结果

2.1 BALF中炎症因子含量 采用ELISA法测定各组大鼠BALF中的炎症因子的含量，将各组检测结果进行比较，与对照组相比，羊水栓塞组肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6明显升高(P<0.05)，乌司他丁组以上指标较羊水栓塞组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明羊水栓塞后予以乌司他丁治疗能够降低大鼠肺部炎症水平，与对照组相比，乌司他丁组BALF中的TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6仍高(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠BALF中炎症因子的含量(n=5)

2.2 肺组织HE染色 羊水栓塞组大鼠肺组织可见不同程度水肿,局部血管丰富,可见少量出血,支气管及血管的周围有大量炎症细胞浸润;乌司他丁组肺组织病理改变较羊水栓塞组减轻;对照组大鼠肺组织则无明显改变,见图1，可见予以乌司他丁治疗能够减轻羊水栓塞大鼠肺部病理损伤。

注：A:对照组；B:羊水栓塞组；C:乌司他丁组

2.3 大鼠肺组织湿干比变化 与对照组相比，羊水栓塞组大鼠肺组织W/D值明显升高(P<0.05)，乌司他丁组较羊水栓塞组W/D值降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明大鼠羊水栓塞后予以乌司他丁干预能够有效的减轻AFE大鼠肺水肿，与对照组相比，乌司他丁组大鼠肺组织W/D值仍高(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肺组织湿干比变化(n=5)

2.4 MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平 RT-PCR检测显示与对照组相比，羊水栓塞组肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达明显升高(P<0.05)，乌司他丁组肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达较羊水栓塞组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明大鼠羊水栓塞后予以乌司他丁干预可能通过降低MMP-2、MMP-9 mRNA表达，发挥降低肺部损伤的作用，与对照组相比，乌司他丁组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达仍高(P<0.05)，见图2。

2.5 MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平 Western blot检测显示与对照组相比，羊水栓塞组肺组织MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高(P<0.05)，乌司他丁组肺组织MMP-2、MMP-9蛋白表达较羊水栓塞组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明大鼠羊水栓塞后予以乌司他丁干预可能通过降低 MMP-2、MMP-9 蛋白表达，发挥降低肺部损伤的作用。 与对照组相比，乌司他丁组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9 蛋白表达仍高(P<0.05)，见图3。

注：A：MMP-2、MMP-9 mRNA电泳图;B:MMP-2、MMP-9 mRNA的表达量

3 讨论

羊水栓塞是指由于羊水进入母体循环后所引起的，敏感母体对羊水成份产生抗原抗体反应以及内源性介质释放，从而引起低氧、低血压导致呼吸循环衰竭等病理改变严重综合征，尽管目前对羊水栓塞的认识和治疗水平有所提高，但是羊水栓塞仍然是孕产妇死亡的主要原因。羊水和或胎粪成份在母体循环引起不受控制的抗原抗体反应和内源性介质释放并进一步发展为急性肺损伤和呼吸循环衰竭[5-8]。炎症介质在羊水栓塞所致的肺损伤中起着着重要的作用，过度的炎症反应会引起肺组织直接损伤并在局部激活炎症级联反应。乌司他丁是从健康男性尿液提取的糖蛋白，其具有对溶酶体膜稳定和抑制溶酶体释放的作用，能够有效抑制氧自由基和心肌抑制因子产生，可以发挥保护组织细胞，调节炎症因子的释放以及改善血液循环的作用。乌司他丁可抑制丝氨酸蛋白酶，并具有抑制炎症介质产生和释放的功能， 能够抑制和消除氧自由基的产生，保护身体器官功能的稳定性。

近期临床及基础相关研究显示，乌司他丁治疗能减轻各种原因所引起的肺部损伤[9-11]，本研究将乌司他丁用于羊水栓塞所致的大鼠肺部损伤的治疗，探讨其保护作用和机制。本研究经股静脉注入自体羊水加胎粪制作羊水栓塞模型大鼠，肺组织病理观察发现大鼠肺组织出现不同程度水肿,局部血管丰富, 可见少量出血, 支气管及血管的周围被大量炎症细胞浸润，表明羊水栓塞模型大鼠模型制作成功，进一步检测显示 羊水栓塞组较对照组W/D 升高，说明损伤后肺组织出现水肿，与羊水栓塞组相比，乌司他丁组大鼠肺组织HE 染色显示肺泡结构得到明显改善，炎症细胞浸润情况降低，乌司他丁组W/D值较羊水栓塞组亦降低，湿干比变化能够反应肺部损伤水肿情况及治疗效果。TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8均为促炎因子，其中TNF-α是一个起始因子，其由单核巨噬细胞及淋巴细胞合成分泌并能引起炎症级联反应，促进其他炎症因子IL-1β、IL-6 和IL-8等的释放，引起肺组织损伤，并诱导淋巴细胞凋亡[12-14]，故检验造摸后及乌司他丁治疗后 TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的水平及变化，能够反映造摸是否成功及治疗后的效果。乌司他丁组BALF中的TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6较羊水栓塞组显著降低，说明乌司他丁能够降低羊水栓塞肺损伤的氧化应激反应，发挥肺功能保护作用，故乌司他丁的应用能够阻断以上病理生理反应，对羊水栓塞所致的肺部损伤发挥保护作用。为了深入探讨乌司他丁减轻羊水栓塞肺组织损伤的可能机制，本研究对各组肺组织MMP-2、MMP-9进行分子生物学检测，既往研究表明MMP-2、MMP-9高表达与肺和支气管细胞基底膜断裂密切相关，其表达水平与肺损伤的严重程度呈正相关，MMP- 2、MMP-9降解的胞外基质片段对炎症细胞还有趋化作用，可放大局部炎症反应，加重肺水肿[15-16]。本研究结果显示羊水栓塞组MMP-2、MMP-9表达高于对照组，经乌司他丁液治疗后MMP-2、MMP-9表达降低，表明乌司他丁可能通过下调MMP-2、MMP-9表达保护大鼠肺功能，减轻肺水肿和炎症反应，发挥治疗羊水栓塞肺组织损伤的作用，当然本研究仍需进一步深入研究，羊水栓塞所致的全身性反应需要综合治疗，药物治疗只是治疗手段之一，临床治疗过程中需要与其他治疗方法联合应用，此外乌司他丁在临床治疗羊水栓塞中的具体疗效，疗程及作用有待进一步进行临床观察及研究。