HPLC法测定排石颗粒中槲皮素和山奈素含量

刘彬果 叶盛英

解放军联勤保障部队第九八三医院，天津 300142

排石颗粒为第九八三医院多年的临床经验方，由金钱草、海金砂、车前草等9味药材组成的复方制剂，方中金钱草甘咸微寒，清热解毒，祛湿热，退黄疸，利胆排石，为君药。石韦、海金沙利水通淋，排石；车前草利水并能清下焦湿热；均为治疗淋病的常用药，为臣药，其有效成分为槲皮素和山奈素。白茅根凉血止血，清热利尿；川楝子苦寒性降，行气止痛；厚朴味辛行散，行气燥湿；枳壳行气宽中，化痰除痞，以上四味共为佐药[1-2]。甘草调和诸药，以为佐使。其现有的标准只有中药定性鉴别的方法，没有主要药味的含量测定方法，为了更好的控制排石颗粒的质量，采用高效液相色谱(HPLC)法以槲皮素和山奈素作为指标成分进行含量测定，经方法学考察，认为本法简便，准确，无干扰，可用于排石颗粒制剂的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，OpenLAB CDS色谱工作站，ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；槲皮素对照品(含量:99.6%,批号：120821-201212);山奈素对照品(含量: 99.8%,批号：120821-201212)购自中国食品药品生物制品检定所；水为超纯水(自制)，甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。排石颗粒(14430137,15260137,15040115,第九八三医院制剂室)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；甲醇-0.4%磷酸(55∶45)为流动相；检测波长为360 nm，进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品、山奈素对照品各适量，精密称定，加80%甲醇溶解，定容，摇匀，制成每1 mL含槲皮素50 μg、山奈素30 μg的混溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取排石颗粒(15040115)约7 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，称定重量，超声处理60 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密量取续滤液25 mL，置50 mL量瓶中，加入盐酸(10%)5 mL，置90 ℃水浴中，水解1 h，取出，迅速冷却，用80%甲醇定容，滤过，取续滤液，即得。

2.4 空白溶液的制备 按处方比例及工艺制备不含金钱草的阴性对照样品，按2.1项下制备方法得空白溶液。

2.5 专属性试验 依据2.1项下色谱条件，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液及空白溶液各10 μL，测定。结果表明，在与对照品溶液色谱图相应保留时间处，供试品溶液有槲皮素和山奈素特征吸收峰，而阴性对照液无相应吸收峰，表明专属性良好。见图1。

2.6 线性关系的考察 分别精密称取山奈素10.2 mg(纯度：93.2%)、槲皮素对照品15.8 mg(纯度：98.0%)，置50 mL容量瓶中， 80%甲醇溶解,定容至刻度，即得对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置25 mL容量瓶中，制备对照品溶液(槲皮素：24.77 μg/mL；山奈素：15.21 μg/mL)。分别精密吸取1 μL、2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，依次进样，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，

得：槲皮素:Y=4263.5X-5.4208，r=0.999 9(n=8);

山奈素：Y=5942.8X-2.8272，r=0.999 9(n=8)。

结果表明，槲皮素在0.025～0.495 μg的范围内，山奈素在0.015～0.304 μg的范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，按2.1项下各色谱条件分别测定，连续进样6次，记录峰面积，槲皮素和山奈素的RSD值分别为1.1% 和0.6%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 同一供试品溶液(15040115)，分别于0、2、4、6、8、9 h和10 h测定，得槲皮素和山奈素峰面积RSD分别为2.1%和1.5%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 同一批样品(15040115)6份，按2.3项下方法制备，依法测定。记录峰面积，计算槲皮素和山奈素的含量的RSD分别为1.7%和1.8%，表明该方法具有良好的重复性。

2.10 加样回收率试验 取已知含量的样品(15040115)6份，每份约4.0g，精密称定，精密加入槲皮素(0.196 mg/mL)和山奈素(0.041 mg/mL)对照品溶液各2 mL，按2.3项下方法制备，按2.1项下条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果槲皮素的加样回收率为97.1%，RSD为2.5%(n=6)；山奈素的加样回收率为100.2%，RSD为1.2%(n=6)。见表1、2。

表1 槲皮素加样回收率试验结果 (n=6)

表2 山奈素加样回收率试验结果 (n=6)

2.11 样品测定 取样品3批(14430137,15260137,15040115)，按2.2项下方法分别制备供试品溶液，照2.1项下色谱条件测定，外标法定量。计算三个批次的样品中槲皮素和山奈素的含量，结果见表3。

表3 三批样品含量测定结果 (n=2)

3 讨论

3.1 指标成分的选择 排石颗粒中金钱草为君药,主要功效成分为黄酮类[1-3],可作为中成药的质量控制指标,在本研究中,选用黄酮类水解产物槲皮素和山奈素作为指标成分测定，以其含量作为质量控制的考察指标。

3.2 测定波长的选择 参照中国药典中金钱草的含量测定方法[4],经光谱扫描,槲皮素和山奈素在360 nm处均有较大吸收，故选取360 nm作为检测波长。

3.3 提取条件的选择 在供试品的制备过程中, 采用超声提取的方法,该方法简单，便于操作。同时对于提取时间进行考察，考察了超声处理40 min、60 min、80 min，研究发现，60 min超声处理样品可达到提取完全的目的，采用超声提取60 min的方法制备供试溶液。

黄酮类化合物在植物体内常与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，为了准确测定其苷元的的含量，需进行水解去糖。参考相关文献及药典方法[5-7]，采用酸水解法，考察了糖水解时的温度、盐酸含量、水解时间等，采用90 ℃水浴中加热水解1小时，甲醇与10%盐酸体积比为5∶1时，峰面积之和达到最大。因而，确定采用超声60 min，90 ℃水浴中加热水解1 h制备供试品溶液。

3.4 流动相的选择 因黄酮类成分含有酚羟基,呈弱酸性,故选择酸性缓冲系统,参照药典及相关文献[8-11]报道,采用甲醇-0.4%磷酸(55：45)为流动相；检测波长：360 nm；流速：1.0 mL.min-1；柱温：室温。可达到很好分离效果。

经方法学考察，本方法简单,结果准确,重复性好,无干扰,可用于排石颗粒的质量控制。

A：对照品溶液图谱；B：样品溶液图谱；C：阴性对照溶液图谱；1.槲皮素 2.山奈素图1 槲皮素和山奈素HPLC图谱