羟氯喹对IgA肾病大鼠肾脏病理和Toll样受体4表达的影响

李优，姜红，李维

（中国医科大学附属第一医院儿科，沈阳 110001）

IgA肾病 （IgA nephropathy，IgAN） 是最常见的原发性肾小球疾病之一，不同国家患病率有很大的差异。13个欧洲国家的肾脏疾病数据显示，22%的肾脏病患者确诊为IgAN，在日本和泰国IgAN的发病率为39%，而在中国原发性肾小球肾病患者中超过40%确诊为IgAN，并且患病年龄趋于年轻化［1-3］。目前IgAN的发病机制尚不十分清楚，亦无明确有效的治疗方法。IgAN的临床治疗一般采用糖皮质激素作为基础治疗，根据患者病情使用免疫抑制剂，如环磷酰胺与霉酚酸酯等，但药物相关不良反应较重，且IgAN仍是终末期肾病的主要病因之一。因此，明确IgAN发病机制、寻找有效的治疗方法仍是目前急需解决的热点问题。

羟氯喹是临床常用的的抗疟药物，已被用于系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的临床治疗中，可通过抑制炎症信号通路、减少炎性细胞因子来调节机体免疫反应。IgAN是以IgA沉积为主的免疫相关性肾小球疾病，本研究通过观察IgAN大鼠在羟氯喹治疗前后肾脏病理和Toll样受体4 （Toll-like receptor 4，TLR4） 表达水平的变化，探讨羟氯喹对IgAN的免疫治疗作用，为IgAN的治疗提供新的治疗措施。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量 （150±10）g，购自并饲养于中国医科大学实验动物部。所有实验均符合实验动物使用的伦理学要求，并获得中国医科大学动物伦理委员会的批准 （批准编号：2018046）。

1.2 方法

1.2.1 IgAN大鼠模型的制备和分组：将24只大鼠随机分为3组：对照组、IgAN组、羟氯喹治疗组 （HCQ组），每组8只。IgAN组和HCQ组：先制备IgAN模型，给予400 mg·kg-1·d-1牛血清白蛋白 （1 ∶10，美国Sigma公司） 隔天灌胃，共8周，同时每周1次皮下注射蓖麻油 （0.3 mL，大连美仑生物科技有限公司） 和CCl4（0.1 mL，辽宁新星试剂有限公司），共9周，分别在第6周初和第9周初，经尾静脉注射0.05 mg脂多糖（美国Sigma公司） 0.2 mL。对照组：0.4 mL蒸馏水灌胃，0.4 mL生理盐水皮下注射，0.2 mL生理盐水尾静脉注射。第9周末，每组随机处死1只大鼠，取肾组织行免疫荧光染色，鉴定IgAN造模成功。

1.2.2 羟氯喹干预治疗：HCQ组大鼠给予54 mg·kg-1·d-1羟氯喹灌胃 （上海上药中西制药有限公司），对照组和IgAN组大鼠给予4 mL·kg-1·d-1蒸馏水灌胃，持续8周。第17周末，给予大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后处死，摘除肾脏，取部分肾皮质，置于标准固定液中，常规石蜡包埋。

1.2.3 苏木素-伊红染色：按照苏木素-伊红试剂盒 （北京索莱宝试剂有限公司） 说明书进行操作。常规脱水、透明、中性树胶封片，在光镜视野下观察拍摄。

1.2.4 Masson染色：按照Masson染色试剂盒 （福州迈鑫生物科技发展有限公司） 说明书进行操作。常规脱水、透明、中性树胶封片，在光镜视野下观察拍摄，应用ImageJ软件分析胶原纤维面积百分比。

1.2.5 直接免疫荧光染色：大鼠肾组织石蜡切片，经柠檬酸盐缓冲液高压修复，滴加FITC标记的IgA荧光抗体 （美国Abcam公司，ab97184），4 ℃避光过夜。滴加抗荧光淬灭剂，中性树胶封片。在荧光显微镜视野下观察拍摄，应用ImageJ软件分析IgA沉积荧光强度，按照国内外通用的5级半定量法（-～++++）判定。

1.2.6 免疫组织化学染色：大鼠肾组织石蜡切片，经柠檬酸盐缓冲液高压修复，滴加抗TLR4/MD2复合物抗体 （1 ∶100，美国Abcam公司，ab95562） 约50～100 μL，4 ℃避光过夜。二抗孵育30 min，DAB染色，常规脱水、透明、中性树胶封片。在光镜视野下观察拍摄，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析TLR4表达情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。所有结果均以表示。Masson染色和直接免疫荧光染色数据呈正态分布及方差齐，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，免疫组织化学染色数据方差不齐，组间比较采用Dunnett T3检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

对照组：大鼠毛发顺滑有光泽，进食正常，体质量匀速增长，平均每周增长14.5 g，精神状态良好。IgAN组：大鼠毛发蓬乱晦暗、无光泽，进食减少，体质量增长慢，平均每周增长10.6 g，精神状态萎靡。HCQ组：大鼠毛发整齐略晦暗、进食正常，体质量增长稍慢，平均每周增长11.0 g，精神状态适中。

2.2 肾组织病理改变

2.2.1 HE染色观察肾脏形态学改变：光镜下观察，对照组肾小球和肾小管正常，肾小球间质未见炎症细胞浸润；IgAN组肾小球萎缩，弥漫性肾小球系膜区增宽，肾小管上皮细胞肿胀脱落，间质炎症细胞浸润；HCQ组肾小球系膜区轻度增宽，肾小管上皮细胞脱落，炎症细胞浸润至肾间质。与IgAN组相比，HCQ组大鼠肾组织炎症细胞浸润和系膜细胞增生情况明显改善；与对照组相比，HCQ组肾脏病理损伤仍比较明显。见图1。

图1 肾组织HE染色分析 ×400Fig.1 HE staining of the kidney tissue ×400

2.2.2 Masson染色观察肾脏纤维化程度：光镜下观察，与对照组相比，IgAN组和HCQ组大鼠肾内蓝色胶原蛋白沉积明显增多；与IgAN组相比，HCQ组肾内蓝色胶原蛋白沉积明显减少。结果显示，IgAN组大鼠肾组织纤维化面积比例［（2.469±0.312） %］显著高于对照组［（0.624±0.173） %］和HCQ组［（1.494±0.315） %］，HCQ组大鼠肾组织纤维化面积比例明显高于对照组，差异均有统计学意义 （P＜ 0.05）。见图2。

2.3 直接免疫荧光染色法检测系膜区IgA沉积

图2 肾组织Masson染色分析 ×200Fig.2 Masson’s staining of the kidney tissue ×200

荧光显微镜下观察，对照组系膜区无明显IgA荧光沉积，荧光强度为（-）；IgAN组可见系膜区强的绿色IgA荧光沉积，荧光强度为（++～+++）；HCQ组可见系膜区较弱的绿色IgA荧光沉积，荧光强度为（-～++）。统计分析结果显示，与对照组［（0.000±0.000）ng/L］相比，IgAN组［（577.293±168.973） ng/L］和HCQ组［（136.750±54.373） ng/L］IgA沉积密度明显增加（P＜ 0.05） ；与IgAN组相比，HCQ组IgA沉积密度明显降低 （P＜ 0.05）。见图3。

2.4 免疫组织化学染色检测TLR4表达

光镜下观察，对照组大鼠肾内无褐色颗粒沉积，IgAN组大鼠肾内可见明显增多的褐色物质。与IgAN组相比，HCQ组褐色物质沉积明显减少。结果显示，与对照组［（0.098±0.023） %］相比，IgAN组［（0.754±0.166） %］和HCQ组［（0.299±0.073） %］肾组织内TLR4阳性表达率均明显升高 （P＜ 0.05） ；与IgAN组相比，HCQ组肾组织内TLR4阳性表达率明显降低 （P＜ 0.05）。见图4。

3 讨论

IgAN病理特征为肾小球系膜区IgA （低糖基化的IgA1为主） 沉积或伴有C3沉积，肾小球系膜细胞增生与细胞外基质增加，是影响IgAN肾功能进展的重要危险因素［4-5］。本研究中，IgAN大鼠肾内出现大量炎症细胞浸润、系膜细胞增生和肾纤维化，系膜区有大量IgA沉积，表明大鼠肾组织损害严重，一般状态亦明显下降。目前IgAN的发病机制尚不清楚，近年研究发现，TLR4参与IgAN的发生、发展过程。

图3 IgA沉积的直接免疫荧光分析 ×400Fig.3 IgA deposition analyzed by direct immunofluorescence assay ×400

图4 TLR4表达的免疫组织化学分析 ×400Fig.4 TLR4 expression analyzed by immunohistochemical staining ×400

TLR4广泛存在于哺乳动物的先天免疫系统中，介导一种紧密集成的信号转导，识别病原体相关的分子模式，通过MyD88依赖通路和MyD88独立通路共同调节促炎性细胞因子和趋化因子的表达，产生有效的促炎症和纤维化的介质。越来越多的研究表明，TLR4是调节肾脏免疫炎症反应的关键细胞因子。LI等［6］发现，抑制TLR4介导的核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）/丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinases，MAPK） 信号通路，能够减轻炎症反应，减少细胞外基质的积累，并改善单侧输尿管阻塞小鼠的肾纤维化程度。目前，对于TLR4参与IgAN的致病机制也逐渐明确，随着IgAN患者外周血单核细胞中TLR4mRNA转录和表达增多，血清中单核细胞趋化因子-1和白细胞介素（interleukin，IL） -6的表达也相应增加［7］。本研究发现，与对照组相比，IgAN组大鼠TLR4表达明显增多，肾脏炎症反应和肾纤维化程度均显著增强，IgA沉积增多，证实TLR4参与IgAN大鼠肾内炎症反应发生，并提示TLR4的表达与肾内IgA沉积相关。

近年来，羟氯喹作为免疫抑制剂对调节自身免疫反应有显著作用，能够降低α干扰素、IL-6和肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子的产生，口服后易分布在皮肤、肝、肾等器官，易通过细胞膜，生物利用率高，也能够通过胎盘发挥作用，维持较高的血药浓度。WU等［8］提出，羟氯喹能降低类风湿性关节炎患者继发性慢性肾脏病的发生风险。近来研究发现，羟氯喹作为免疫抑制剂，治疗IgAN的效果也越来越明显。在氯沙坦和肾素-血管紧张素-醛固酮抑制剂治疗IgAN的基础上加用羟氯喹，能加强对IgAN患者肾脏的保护作用，明显降低IgAN患者蛋白尿水平［9-11］。为了进一步明确羟氯喹对IgAN的病理改善作用，本研究给予IgAN大鼠羟氯喹治疗，发现3组大鼠肾脏病理改变有明显差异，与IgAN组大鼠相比，HCQ组大鼠肾小球系膜细胞增生程度减弱，炎症细胞浸润减少，纤维化程度、IgA沉积密度和TLR4阳性表达率均显著下降 （P＜ 0.05），表明羟氯喹能够通过抑制免疫炎症反应减轻肾损伤。

BAI等［12］发现羟氯喹能够抑制NF-κB、IL等相关炎性细胞因子的释放，减轻炎症反应，改善IgAN大鼠肾脏功能。还有研究［13］证实，TLR4在调节NF-κB、IL和TNF-α等炎性细胞因子的表达过程中起重要作用。目前，羟氯喹治疗IgAN过程中TLR4的作用机制尚未明确。本研究发现，相比于IgAN组大鼠，HCQ组大鼠肾内TLR4表达明显被抑制，炎症细胞减少，证明羟氯喹可通过抑制TLR4的表达发挥抗炎作用，减少肾纤维化形成、系膜区IgA沉积。

综上所述，羟氯喹能够通过抑制TLR4的表达，减轻大鼠肾脏病理损伤，对IgAN大鼠肾脏有保护作用。但羟氯喹对抑制系膜细胞增生的作用机制仍需进一步研究，而且本研究基于大鼠实验，观察时间较短，应同时结合临床患者的病例研究，进一步明确羟氯喹对IgAN患者的临床治疗意义。