芦苇不同器官乙醇提取物对3种植物种子和幼苗的化感作用

崔 雯，凌宇轩，王子纯，杨从军

(青岛农业大学植物医学学院，山东省农作物病虫害综合防控重点实验室，山东 青岛 266109)

芦苇(Phragmitesaustralis) 是一种普遍存在的湿地植物，被公认为世界上最烈性的入侵植物之一，在全球不同区域、地区扩展分布形成稠密的单一群落[1]。由于它的入侵，其它植物区系和群落被显著削弱或改变，生物多样性和生态功能严重退化[2]。芦苇强大的生态竞争优势被归因于化感作用[3]。芦苇水提取物、分解的植物残体、根分泌物和一些鉴定的特异化合物具有强烈的植物毒性，抑制其它植物萌发、生长和种群的建立[4,5]。

化感化合物可在植物叶、茎、根、种子、花，甚至花粉各部分以不同浓度存在[6]，并通过4种方式释放到环境中。叶表分泌物通过雨水淋洗；绿色组织部位挥发性化合物的分泌；植物残体降解；以及根的分泌。化感作用在植物种群动态建立和种类分布方面起着关键作用，关于化感作用目前有2个假说，一是化感作用是协同进化的结果，二是逆境条件迫使植物合成更多的次级代谢防御性物质[7]。各种不同类型的非生物和生物逆境可改变化感化合物的产生与释放，加强了化感化合物作为次级代谢产物在植物各器官的组织特异性[8]。为进一步探索芦苇的化感作用，以小麦、萝卜、黄瓜为受体植物，测定芦苇叶、茎、根、花各器官乙醇提取物对种子萌发和幼苗生长的影响，为有效利用芦苇野生资源和开发新的植物源除草剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

芦苇材料采自山东省青岛市城阳区惜福镇。芦苇叶和茎采于10月，芦苇花采于11月，芦苇根采于次年3月。将芦苇各器官分别置于通风阴凉处阴干，粉碎，低温保存备用。

小麦Triticumaestivum(邯郸6172)、萝卜Raphanussativus(大连青)和黄瓜Cucumissativus(85 F 12)种子，购于山东省青岛市城阳区种子站。

1.2 方 法

1.2.1芦苇各器官乙醇提取物对种子萌发和幼苗生长的影响

称取芦苇根、茎、叶、花的干粉各100 g，分别用95%乙醇室温浸提3次,每次加入95%乙醇500 mL，提取时间分别为1 d，3 d，5 d。合并3次滤液，减压浓缩，用乙醇定容，得50 mL浓缩液。

取浓缩液2.5 mL，用乙醇稀释至30 mL，取稀释液3 mL，相当于植物干粉0.5 g，加入直径9 cm的培养皿，于通风橱中将溶剂挥发后，加入5 mL无菌水，计乙醇提取物浓度100 mg·mL-1。均匀摆放10粒种子，腹沟朝下，置于25 ℃恒温箱中，黑暗培养。一定时间后检查种子萌发情况，种子萌发以芽长大于1 mm左右为标准[9]，计算种子萌发抑制率。

种子萌发抑制率(%)=[(对照种子萌发率—处理种子萌发率)/ 对照种子萌发率]×100%。

取浓缩液4 mL，用乙醇稀释至30 mL，取稀释液3 mL，相当于植物干粉0.8 g，用于对幼苗生长的影响测定，过程同上，培养皿中加入5 mL无菌水后，计乙醇提取物浓度160 mg·mL-1。将已催芽露白的小麦、萝卜和黄瓜种子各10粒，均匀摆放于培养皿中，置于光照培养箱光照/黑暗(12 h/12 h)，25 ℃培养，2～3 d后检查幼苗生长情况，分别计算对幼苗根长和茎长的抑制率。

根(茎)长抑制率(%)=[对照平均根(茎)长—处理平均根(茎)长)]/对照平均根(茎)长 ×100%。

1.2.2芦根提取物对种子萌发和幼苗生长的影响

称取芦苇根粉4.0 kg，加入12 L 95%乙醇，电动搅拌提取多次，至提取液无色，合并提取液，减压浓缩，得提取物600 g。将提取物与500 g硅藻土充分拌匀，避光条件下自然晾干，呈粉末状。然后依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇萃取，每种溶剂多次萃取至溶剂近无色后，抽滤，滤渣在45 ℃烘干，用于后一溶剂萃取。分别合并各萃取溶剂滤液，浓缩，最终得石油醚萃取相30.286 g、乙酸乙酯萃取相19.338 g和甲醇萃取相500 g。

准确称取芦根乙醇提取物、芦根乙醇提取物的石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相和甲醇萃取相，用相应萃取溶剂配制成40 mg·mL-1、80 mg·mL-1和100 mg·mL-1溶液。分别取上述溶液5 mL到培养皿中，待溶剂挥发殆尽后，加入5 mL无菌水，均匀摆放小麦、萝卜和黄瓜种子，进行影响种子萌发与幼苗生长试验，方法同1.2.1。

1.2.3统计方法

采用IBM SPSS Statistics 20软件进行数据分析，所有数据以Mean表示。

2 结果与分析

2.1 芦苇各器官乙醇提取物对种子萌发和幼苗生长的影响

在100 mg·mL-1时，萝卜种子萌发对芦苇各器官乙醇提取物敏感性远大于黄瓜和小麦，受抑制作用较强，抑制率为11.9%～31.0%；芦苇各器官提取物对小麦种子的萌发抑制率低于5.0%，对黄瓜种子萌发的抑制率均在10.0%以下。从芦苇各器官乙醇提取物的抑制活性看，芦根乙醇提取物较强，对萝卜种子萌发的抑制率最高达31.0%(表1)。

在160 mg·mL-1时，芦苇各器官乙醇提取物对3种受体植物根、茎生长抑制作用较强。对小麦和萝卜根长的抑制大于对茎长的抑制，抑制率相差分别为10.1%～18.7%、27.0%～30.7%，存在差异显著。芦苇叶、茎、花的乙醇提取物，分别对黄瓜幼苗根、茎生长抑制作用相当，茎长抑制率略高于根长抑制率；而芦根乙醇提取物对黄瓜幼苗根长抑制率为51.0%，比茎长抑制率高20.4%。从芦苇各器官乙醇提取物对受体植物幼苗根长和茎长的作用看，芦根乙醇提取物抑制作用最强，其次是芦苇叶和茎的乙醇提取物，两者作用相当，芦花乙醇提取物抑制活性最弱(表1)。

综合来看，无论是对种子萌发的抑制，还是对幼苗根长、茎长的抑制，芦根乙醇提取物活性均高于芦苇叶、茎和花的乙醇提取物。因此，以芦根为材料进行下一步的活性研究。

2.2 芦根乙醇提取物及其萃取相对种子萌发和幼苗生长的影响

芦根乙醇提取物及其萃取相对小麦、萝卜和黄瓜种子萌发抑制作用存在明显差异，乙酸乙酯萃取相活性显著，对种子萌发抑制作用最强。在40 mg·mL-1时，乙酸乙酯萃取相对萝卜种子的萌发抑制率已达100%，对小麦和黄瓜种子的萌发抑制率也分别达62.1%和24.8%；当100 mg·mL-1时，乙酸乙酯萃取相可完全抑制3种受体植物种子萌发。从试验结果可知，芦根乙醇提取物中抑制种子萌发的活性成分，通过萃取主要转移到乙酸乙酯萃取相中，使得石油醚萃取相和甲醇萃取相的活性在40 mg·mL-1时较差，而芦根乙醇提取物可能含更多非活性成分，对种子萌发抑制作用也远低于乙酸乙酯萃取相(表2)。

在供试浓度下，芦根乙醇提取物及其萃取相对小麦、萝卜和黄瓜幼苗的根长均有强烈抑制。在40 mg·mL-1时，石油醚萃取相和甲醇萃取相对黄瓜幼苗的根长抑制作用最小，抑制率分别达55.2%、59.4%，其它各处理抑制率均在75%以上；乙酸乙酯萃取相对3种植物幼苗的根长抑制率分别为89.3%、90.9%和82.0%，表现最好抑制活性，说明抑制幼苗根长的成分同样主要转移到乙酸乙酯相中。各处理抑制作用均有浓度依赖性(表3)。

表2 芦根乙醇提取物及其萃取相对种子萌发的抑制作用

表3 芦根乙醇提取物及其萃取相对幼苗根长的抑制作用

表4 芦根乙醇提取物及其萃取相对幼苗茎长的抑制作用

在试验浓度下，芦根乙醇提取物及其萃取相对小麦、萝卜和黄瓜幼苗的茎长均有强烈抑制，抑制作用具有浓度依赖性。在40 mg·mL-1时，石油醚萃取相对茎长抑制作用最小，对3种植物幼苗茎长抑制率分别达59.9%、42.2%和37.4%。综合来看，乙酸乙酯萃取相的抑制作用最强，抑制率分别为79.1%、70.1%和86.8%；其次为芦根乙醇提取物、甲醇萃取相和石油醚萃取相(表4)。

3 结论与讨论

在一定浓度下，芦苇根、茎、叶、花各器官乙醇提取物对小麦、萝卜和黄瓜3种受体植物种子萌发(100 mg·mL-1)、幼苗生长(160 mg·mL-1)均有抑制作用。无论是对种子萌发抑制，还是对根长、茎长的抑制，芦根提取物活性均高于芦苇叶、茎、花的提取物。对芦根乙醇提取物进行萃取分离，对受体植物起抑制作用的活性成分主要转移到乙酸乙酯萃取相中。在40 mg·mL-1时，乙酸乙酯萃取相对小麦、萝卜和黄瓜种子萌发抑制率分别为100%、100%和62.1%；对幼苗根长的抑制率分别为89.3%、90.9%和82.0%；对幼苗茎长的抑制率分别为79.1%、70.1%和86.8%。乙酸乙酯萃取相对种子萌发、幼苗生长的抑制作用显著强于芦根乙醇提取物及石油醚萃取相、甲醇萃取相。试验结果证实芦苇是一种强化感植物，从芦根中追踪分离影响植物生长的活性成分，可能发现新的除草活性优异的化合物。

植物通过释放化学物质作用邻近植物，这些化学物质释放很重要的一个途径就是根的分泌。根分泌物介导的化感作用已在许多植物上报导[10]，如矢车菊根分泌物对许多杂草、包括小麦和番茄在内的作物均有植物毒性[11]。芦根分泌物对包括模式植物拟南芥在内的多种植物均有强烈的根茎毒性，可导致受体植物的根黑化和坏死，这与根中具有潜在的植物毒素相关[12]。从芦根分泌物中分离的没食子酸，通过诱导活性氧的产生，破坏微管装配，并最终破坏根的组织结构。没食子酸对单子叶植物互花米草、早熟禾、牛毛草有强烈根茎毒性，对水稻和小麦无影响[13]。但在本试验中，芦根提取物对小麦种子萌发、幼苗根长、茎长的抑制率最高分别达62.1%、89.3%和79.1%，可导致小麦根的褐变、坏死。因此，在芦根中存在影响植物生长的化感化合物需进一步研究。芦苇不同品种、不同生境和不同生育期都可能存在不同活性次级代谢产物，导致化感化合物在种类和数量上的可变性、复杂性。芦苇中存在的其它酚酸类化合物，如鞣花酸同样具有植物毒性[14]，李锋民等从芦苇中分离出的甲基乙酰乙酸乙酯，能抑制蛋白核小球藻和铜绿微囊藻的生长[15]。因此，扩大活性筛选受体植物，追踪芦根中影响植物生长的活性成分，将更深入地解析芦苇强化感作用的物质基础并加以利用开发。