基因库种质资源生活力监测间期及监测策略的探讨

2020-12-24李玉荣王荔枫王梅娟

种子 2020年10期

李玉荣，洪军,王荔枫，王梅娟

(1.全国畜牧总站,北京 100125; 2.赤峰市巴林右旗林业和草原局，内蒙古巴林右旗 025550)

利用基因库保存种质资源是植物遗传多样性保护的一种经济有效的方法，并被越来越多地用作濒危植物保护的工具之一。随着贮藏时间的延长和保存数量的增加，基因库的管理工作面临挑战。生活力监测是基因库种质资源管理工作的重要内容，通过生活力监测可以发现处于临界值的种质，及时进行繁殖更新，防止种质资源遗传多样性的遗失。基因库中的材料数量繁多，如何在节省种子、节约劳动力及其他资源的情况下做到种质资源的安全保存，是基因库管理工作的重要课题。

目前，为了优化生活力监测制度和方案，分析长期贮藏后种子生活力的研究相当匮乏[2,3]。FAO/IPGRI基因库标准[4]推荐了生活力监测标准，2013年发布了修订版本，对种子生活力监测做了更详细的规定[5]。近年来，国内外陆续出现了有关学者对种质资源生活力监测方面的研究。本文对前人的相关研究进行了综述，对生活力监测间期及监测的策略进行了探讨。

1 生活力监测的间期

基因库中种质资源生活力监测的间期取决于种子初始生活力的大小和种子寿命的长短等因素。初始生活力较低的种子贮存一定时间后，监测结果不合格的概率较高[3]。

FAO/IPGRI基因库标准[4]中规定，在适宜的贮藏条件下，对于初始发芽率较高的种子，一般应在10年后进行第1次监测试验，对贮藏寿命较差或初始品质较差的种子应在5年后进行检测。FAO/IPGRI修订后的标准[5]中，生活力监测间隔设置为预测种子生活力下降到初始生活力的85%或更低所需时间的1/3，但最长不应超过40年。同时，在标准中技术部分要求生活力监测间隔要根据发芽试验数据进行调整，一旦检测到显著下降，就应该减小监测间隔，“微调”预测时间。频繁进行发芽试验监测种质材料不仅费工，而且会消耗种子资源，造成种子数量减少，需要提前进行更新，同时，频繁的更新又增加了选择、遗传漂变和遗传完整性丧失的风险[1]。因此，谨慎的管理应该尽可能不频繁地进行监测测试[6]。

预测种子的寿命是确定生活力监测间隔的基础，而不同物种之间的种子寿命存在相当大的差异[7]。Roberts[8]根据农作物种子在各种不同温度和水分条件下，预测种子贮藏寿命，提出了种子生存方程，后来Ellis和Roberts[9]根据多年的研究结果，对生存方程进行了修正，其中最重要的修正是将种子原始发芽率考虑在内。有研究表明，利用这个指数关系对短期贮藏种子的寿命可以成功预测，但是对于长期贮藏种子寿命预测的应用价值是有限的[6]。一方面不能长期精准地保持设定标准的贮藏环境，比如设备或电源故障造成的停机、维修及更换，常规工作中员工的进出等多种因素，都会引起温度的波动变化，由于贮藏寿命与贮藏环境呈指数关系，短时间内在较高温或含水量高于预先设定标准，都对种子实际贮藏寿命有较大影响。另一方面，种质资源可能来自多种来源，收获、干燥和短期贮藏的背景也不同，种子批有可能是不均匀的，很难对种子生存期进行量化。因此，种子生存方程的预测可作为潜在种子贮藏寿命的指导，但不能替代长期贮藏中获得的实际经验[6]。到目前为止，仅对数量有限的物种提供了生存常数的估计，对于大多数植物种来说，很少或没有基于证据的寿命预测，因此对基因库管理方面的建议相对有限[6]。

据估计，全球有1 750个基因库，保存了约740万份种质材料[10]，这些基因库已经运行多年，对生活力监测的数据分析可以作为生活力监测间隔的参考。

我国国家作物种质库中23种作物1.8万多份种子在-18 ℃下贮藏10年后，大部分种子生活力仍保持较高水平，只有95份材料出现了明显的下降。其中,胡萝卜、莴苣、棉花、胡麻、蓖麻等5种作物种子整体发芽率平均值都出现了显著下降[11]。国家蔬菜资源中期库中保存的6种葱属蔬菜共610 份资源经过 21～30 年贮存后，6种葱属种子生活力均呈显著下降趋势, 建议对贮藏20 年以上的种子增加监测频率，将监测间期从10年缩短至5年[12]。覃初贤等[13]在对广西农科院种子库的野生稻种资源生活力监测数据分析后,建议把不耐贮藏的作物(类型)和对生活力整体出现明显下降类型的种子作为重点监测对象，3～5 年检测 1 次并及时进行繁殖更新。我国国家作物种质库油菜种子在长期库(-18 ℃)中保存15 年后，发芽率出现显著下降，因此建议对长期库中保存的野生近缘种或者贮藏时间在 15 年以上的油菜种子进行密集监测[14]。国内的相关研究大多集中在对保存数年种子的监测数据分析,根据生活力下降情况提出的建议，对于确定相应物种的生活力监测间期有借鉴参考价值，只是种类数量不多。Ellis等[6]对国际畜牧研究所中期库(含水量5%，温度约8 ℃) 中50个属的豆科牧草种子贮藏30年的生活力监测数据进行了分析，利用probit分析方法拟合各种子批的累积正态分布，与种子生存方程计算的预期寿命进行比较。结果表明，在豆科种子的50个属的植物中，有47个属的种子生活力达到或超过了中期种质存贮的预期存贮期，Ellis的研究结果表明，通过种子生存方程预测种子寿命所获得的生活力监测间期可以在种子生活力监测中利用。Treuren等[3]对荷兰遗传资源中心近4万份种子(平均初始发芽率栽培种为92.3%，野生种为82.3%)的生活力监测数据进行了分析，多种作物种子在-20 ℃保存时间超过25年(含水量3%～7%，近真空铝箔袋包装)，结果表明，更新后存贮25年，绝大多数种子活力保持良好，因此，建议长期库种子的第1次种子生活力监测推迟到更新后25年进行。Ellis等[6]提出，如果有足够的数据，建议从物种水平而不是属的水平上进行分析，在Treuren[3]和Ellis[6]的研究中，由于生活力显著下降的种子数量相对较少，都没有对单个具体物种进行分析研究，并且在Treuren等[3]的研究中涉及作物种类也相对较少，不宜将少数物种的数据推断到其他物种。Trapp等[2]开发了一个数据通知方法，该方法拟合了一个具有随机种子批次特定系数的分层贝叶斯种子活力模型，对2833批次(每个批次的种子均有3～7次完整的生活力监测数据)的玉米种子制定了生活力监测的日程表,一方面是立足在系统的基础上建立模型，另一方面为平衡快速捕获衰退种子的重要性和过早检测的成本，通过对ROC曲线分析及后续测试，确定使用预测合理的分位数作为再次测定时间。

对于不能预测种子寿命的植物种子，FAO[5]发布的《粮食与农业植物遗传资源基因库标准》推荐，如果不能估计种子的劣变期，并且材料长期保存在- 18 ℃的密闭容器中，预期寿命长的物种应间隔10年，预期寿命短的物种应间隔5年或更短的时间。

基因库国际标准可以用于所有的种质库，在应用时需要根据基因库的具体情况，并与物种特有信息相结合[5]。目前，世界范围内运行的基因库中，一类采用固定的间隔时间进行监测，另一类根据初始发芽率计算间隔时间[15]。此外，基因库设定的监测间隔也可以具有物种特异性，例如美国农业部日内瓦分部中期和长期贮藏条件相同，按照每15年对萝卜进行中期和长期贮藏的种质都进行监测[15]。

优化生活力监测方案，设置合理的生活力监测间期，过度频繁监测会造成大量种子和人力资源的浪费，过少则会错过种子生活力关键节点，造成遗传物质流失的风险，因此，生活力监测应在平衡种质资源潜在流失的风险损失与检测成本(种子、劳动力及其他资源)的基础上设置合理间隔。宋超等[16]提出，从种子入库到种子繁殖更新这个时期即种质安全保存期，可适当延长初次监测时间，在种子安全保存期的末期安排监测或直接安排繁殖更新。种子存活曲线呈倒S形，根据种子活力丧失特性，在平台期可适当延长监测周期，在临近关键节点缩短监测周期，同时根据种子老化信号研究筛选预示种子即将转向骤降期的生物标记作为监测预警指标，建立有效的监测预警方法[17,18]。

种质资源库的管理系统，需要制定一个更复杂的监测预警系统,将多个种子老化信号作为生活力的生物标记集成到一个预测工具中，从而对一个种子群体老化进行全面的有效评估[18]，使管理者不仅仅根据最近发芽试验结果，而且基于其在贮藏中的整体表现，特别是在种质库中预计生存能力下降将以更快的速度发生的情况，能够及时有效地确定种子更新的需求[18,19]。

2 生活力监测的策略

生活力监测除了应设置合理的监测间期，还涉及监测种子范围、种子取样、种子数量、误差估计、发芽试验程序、入库及更新标准等多方面，采取策略不同，都可能会对种子生活力监测结果产生较大的影响。

2.1 监测方式

管理种质资源库，最理想的方法是在种子入库贮存时进行初始试验，预测种子何时达到存活阈值，或者按相对寿命排列种子批次，至少在处理相同种类的材料时进行排序。通过种子最初发芽试验确定一个种子批在贮存时生活力的准确指示信息[20]。种子生活力监测通过对相似材料(比如基于相同的作物种类和更新的年份及地点进行分类)的代表样品进行抽样，而不是对相似材料中的每一个样品进行检测[3], 这样可以在节约种子和其他资源的情况下，兼顾到每个种子批。

国内的一些研究[11，12，21，22]大多倾向于采用逐份监测方式。确定重点监测对象，将不耐贮藏的作物(类型)和生活力整体出现明显下降的某些繁种单位提供的种子[11，12，21]、气候恶劣条件下生产的种质批作为重点监测对象[23]，对于贮藏能力强的种质可适当采用抽样监测[24]。

在长期库和中期库持有同一原始种子样品的情况下，只有在中期库种子耗尽或监测结果表明有必要对长期库种子进行活力测试时，才能对长期库的种质进行监测[25]。中期库种子属的寿命的排序可应用于监测长期库中种子生活力属的优先级排序[6]。此外，可以利用种子活力方程[9]与温度常数一般估计值(跨物种)[26]定量估计两种不同贮藏温度下种子贮藏寿命的可能差异。

目前，有一些基因库定期测试所有的存储种子样本，有些基因库不定期地随机选择种质进行生活力监测[27]。我国国家农作物种质库从1991年起,有目的地选择部分作物种子进行生活力监测，以了解各种作物种子整体生活力变化情况[11]。

2.2 初次发芽试验时间及接收的标准

2013年修订后的标准[5]要求初次试验在收到样品后尽快测定，最迟在基因库收到样品后12个月完成。大多数栽培作物种子的初始萌发值应超过85%。对于某些特殊的物种，以及通常不能达到高萌发水平的野生种和林木种子，可以接受较低的萌发百分比。在种质库接收的种质是小数量种子的情况下，因这些种子是送来更新的，就没有必要进行种子的初始测试，但更新种子在存贮前必须进行测试[28]。

2.3 发芽试验样品数量

发芽试验结果对基因库管理决策至关重要，因此数据应具有足够的可靠性，而试验样本量是影响可靠性的重要因素[29]。随着试验样品量的增加，试验结果的置信区间收窄，可靠性增加[20]。因此，在初始测试中，应使用更多的种子以增加结果的可靠性，同时为更好地预测后续贮藏中种子活力损失的预期进展提供了可能性。同时，用于发芽的种子数量取决于收集样品数量以及补充库存的难易程度。根据大样本的样品量的多少，用于生活力监测的试验样品可以是25～50粒，样品量小于500粒的材料，也可以取10粒种子作为试验样品，但是少于10粒种子的测试由于样品量太小，无法进行有意义的统计分析，对于难以大量收集种子的物种，样品量小于250粒，可能完全不需要进行生活力测试[30]。FAO[1]依据ISTA发芽测试要求，提出初始发芽测试至少应使用200粒种子，但如果由于资源和(或)种子有限，为节省种子，建议每次监测试验随机抽取50～100粒种子，对于小的种质数量(通常是野生物种的情况)，50粒或更少的种子样本量也是可以接受的, 但是必须认识到发芽率低于阈值的机会很高, 应评估发生这种情况的风险[28]。当种子数量非常有限时，减少生活力监测用种量显然是特别重要的，可以使用序列测定方法。序列测试方法能节省种子，缺点是需要多次统计数据，相对繁琐。

2.4 发芽试验方法

发芽方法是关系到试验结果准确性的重要因素。发芽试验应尽量使用最佳条件和适当的打破休眠的处理，使得所有具有生活力的种子能够发芽[28]。目前，大多数基因库使用ISTA国际检验规程中的发芽方法。在ISTA国际检验规程中，包括重要的农业和蔬菜种子、树和灌木及花、草本和药用植物种子。

基因库中收集的很多野生植物种子，许多种类没有标准发芽方法。对于没有方法的种子需要建立种子的发芽方法。优先使用发芽试验方法，当不能去除种子休眠时，可以进行其他测试。有些种子在较宽的条件下具有较强的耐受性和萌发能力，但只有在最适条件下才能完全萌发。在最适条件下也不能萌发的种子就是种子休眠。种子休眠问题是生活力监测中的难题，休眠的混淆效应会干扰对生活力监测临界点的识别。种子休眠随时间的推移也发生着动态变化，初始测定方法和贮藏一定时间后的监测方法可能也会不同。在监测中，破除种子休眠方法应用在已解除休眠的种子上，有时候不适合或者会伤及种子。

种子的发芽方法是否合适，可以采用统计方法进行评估。如果大多数或所有有生活力的种子已经发芽，有生活力种子和萌发种子之间没有显著差异时，则认为设定的发芽条件是合适的[30]。

2.5 误差

影响误差大小的因素很多。基于取样效果的误差水平远远高于预期[3]，因此要尽量取得种子批中有代表性的样品，从而降低取样误差。

误差的大小与种子发芽率的高低密切相关。随着种子发芽率的降低，误差也会增加[28]。当发芽率为50%时，误差最大，当发芽率由50%降低到0或增加到100%时，误差是逐渐降低的。

降低发芽试验的误差能够明显提高效率[3]。因此，对需更新的样品结果有必要进行可靠性鉴定，避免根据不可靠的发芽试验结果进行不必要的更新[29]。为此，对低于阈值发芽结果要进行重新测试，以减少或避免由于误差导致的不合理更新决策。

2.6 繁殖更新标准

基因库管理的目标是长期保持高活力的种质,为确保基因库中保存种质的质量和数量，基因库必须进行繁殖更新。更新繁殖，生产质量和数量最佳的新种子，应以最小的遗传完整性损失达到最大的成本效益[31]。

在种子基因库中，以种子方式保存了几十年或几百年的遗传资源，贮藏期间或频繁更新期间的死亡率会造成遗传侵蚀的风险[32]。当生活力下降到初始生活力85%以下时，或当剩余种子数量少于要求的种质代表群体3次播种量时应该进行更新[28]。对于匀质的样品，贮存期间遗传侵蚀的风险很低，只要在更新时植物是足够的，发芽率可以低于85%。对于不匀质的样品如野生种类和地方品种，必须坚守85%的标准。对一些地方种、特殊种质、野生种和森林种，新补充种子的生活力中很少能达到85%。在这种情况下，可以选择设定比较低的生活力标准触发指标值，如70%或更低[28]。

目前,国内的基因库尚未有统一的标准[21]，我国国家农作物长期库以发芽率为60%作为自花授粉作物(自交系)更新繁殖的临时执行指标,地方种以发芽率下降到起始发芽率的85%进行更新繁殖[33]。