嗜热链球菌富硒及抗氧化性研究

景晨茜，马 玲

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

硒是人体所必需的微量元素之一，在自然环境中以无机硒和有机硒的形式存在，其中，无机硒主要为单质硒、硒化物、亚硒酸盐等，有机硒主要为硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、二甲基硒等[1]。大多数无机硒的毒性比有机硒大，难以被机体所吸收利用，而有机硒及单质硒的吸收利用率较高[2-3]。硒作为生物体内酶的活性组分，参与清除自由基和过氧化物，具有抗氧化性；还可增强机体免疫力，能拮抗多种有毒重金属元素和一些物质[4]。缺硒易患克山病和大骨节病；但机体摄入过量的硒则会引起硒中毒，出现脱发、脱甲等。

中国营养学会推荐人体对硒的摄入量为55～400 μg/d，但在普通食物中的硒含量较低，无法满足人体所需，可通过硒的生物转化得到利用率较高的含硒物质。硒转化载体中的微生物具有繁殖快、适应性强、代谢能力强等特点。有研究表明，乳酸菌可通过自身的理化作用，对绝大多数微量元素进行富集及有机态的转化。1995 年，CALOMME 等[5]首次发现，乳酸菌对无机硒具有一定的富集作用。

本试验通过研究一种嗜热链球菌在富硒24 h后的酸度、菌落数、黏度的变化及抗氧化活性，旨在为进一步研发新的补硒制剂提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与培养基 供试菌种为唾液链球菌嗜热亚种（Strptococcus salivarius）CH 9，由山西农业大学畜产品加工实验室提供；供试脱脂乳培养基为10%脱脂乳，115 ℃灭菌15 min。

1.1.2 试剂 亚硒酸钠，成都麦卡希化工有限公司；磷酸二氢钾，天津申泰化学试剂有限公司；过硫酸钾、ABTS、DPPH，北京索莱宝科技有限公司；所有分析用有机试剂均为国产分析纯；脱脂乳粉，恒天然集团安佳有限公司。

1.1.3 仪器与设备 FE28-Standard pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；NDJ-1 指针式黏度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；7200 型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化及富硒条件的确定

1.2.1.1 菌种的活化 实验室保存的嗜热链球菌选用脱脂乳培养基，以接菌量3%、42 ℃培养24 h进行活化，连续活化3 代。

1.2.1.2 亚硒酸钠浓度的确定 将已灭菌的脱脂乳培养基加入已灭菌的亚硒酸钠溶液，配制培养基中的亚硒酸钠质量浓度为 0、1、2、3、4、5、6、7、8 μg/mL，以接菌量为3%、在42 ℃下培养24 h，观察培养基的颜色。经过一段时间的培养后，发现亚硒酸钠质量浓度为5～8 μg/mL 的培养基底部呈红色，且颜色随其质量浓度的增大逐渐变深，表明这种嗜热链球菌随着亚硒酸钠浓度的增加，转化出的单质硒逐渐增多，有机硒则逐渐减少[6]，不宜作为最适加硒质量浓度。在适宜的硒质量浓度下，乳酸菌的生长代谢受到的影响程度较小[7]。因此，先选用前5 个培养基红色不明显的梯度（0、1、2、3、4 μg/mL，其中，0 为空白组）作为研究对象，初步研究乳酸菌富硒后的理化性质及抗氧化活性的变化。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 滴定酸度测定 其按照GB 5009.239—2016标准[8]进行，采用酚酞指示剂法测定滴定酸度，单位以°T 表示（为每 100 mL 样品消耗 0.1 mol/L 的NaOH 溶液毫升数）。

1.3.2 pH 值测定 采用FE28-Standard pH 计测定pH 值。

1.3.3 黏度测定 采用黏度计测定黏度（测定条件为2 号转子，转速为6 r/min）。

式中，η 表示黏度，K 为系数，α 为转子的偏转量。

1.3.4 菌落数测定 按照GB 4789.2—2016 标准[9]测定菌落数（以M17 为培养基）。

1.3.5 抗氧化性测定

1.3.5.1 样品处理 将10 mL 待测样品与90 mL蒸馏水混匀，得到待测发酵乳。

1.3.5.2 对ABTS+的清除能力 将2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液与7 mmol/L 的ABTS 溶液以1∶1（V∶V）混匀，避光静置 16 h，备用，用 pH 值 6.6、10 mol/L的PBS 稀释混匀液体，使其在734 nm 下的吸光度值为0.70±0.02。取0.5 mL 样品稀释液，分别与5 mL 的ABTS 稀释液和 pH 值为 6.6、10 mol/L 的 PBS 5 mL混匀，作为样品组（A）s和对照组（A）c，同时以0.5 mL蒸馏水与5 mL 的ABTS 稀释液混匀作为空白组（A0）。各组振荡 30 s、暗反应 6 min、4 000 r/min 离心10 min，取上清液在734 nm处测定各组的吸光度值。

1.3.5.3 对DPPH·的清除能力 取3 mL 稀释液，分别与 3 mL 蒸馏水和 3 mL 1.0×10-4mol/L 的DPPH 混匀，作为空白组（Ab）和样品组（Ad），同时以稀释液和 3 mL 无水乙醇混合作为对照组（An）。25 ℃避光条件反应 30 min，4 000 r/min 离心 10 min，测定上清液在517 nm 处的吸光度值。

1.3.5.4 总还原能力的测定 取稀释发酵乳样品的上清液，与 pH 值 6.6、0.2 mol/L的 PBS 2 mL 和 2 mL的1%铁氰化钾混合，50 ℃水浴20 min，加入2 mL的10%TCA，混匀离心后取上清液，加入0.5 mL 的0.1%FeCl3暗处反应至溶液澄清透明，测定样品在700 nm 下的吸光度值。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2019 对数据进行统计分析；采用Origin 9.0 软件进行制图；采用Statistix 8.1软件进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 添加不同质量浓度亚硒酸钠对发酵乳酸度的影响

由图1 可知，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，发酵乳的滴定酸度呈现逐渐下降趋势；当添加亚硒酸钠为 4 μg/mL 时，滴定酸度最小，为 93.77°T；添加1、2 μg/mL 亚硒酸钠与空白组间差异不显著；添加亚硒酸钠3、4 μg/mL 与空白组间差异达显著水平（P＜0.05）。嗜热链球菌产酸能力下降可能是由于加硒时间过早，一定程度抑制了菌体的代谢活动。宋照军等[10]研究发现，嗜热链球菌在对数期菌体代谢旺盛，对硒的转化率较高，且加硒时间越早对菌体代谢活动抑制越强，选择菌体对数期作为加硒时间段。

由图2 可知，添加亚硒酸钠质量浓度越大，嗜热链球菌发酵乳的pH 值越高，这与滴定酸度的结果相符;发酵24 h 后，各组pH 值均低于4.2，嗜热链球菌的产酸能力有所下降，基本停止产酸；当亚硒酸钠质量浓度为 1、2、3 μg/mL 时，与 0、4 μg/mL 亚硒酸钠间差异均达显著水平（P＜0.05）。添加少量亚硒酸钠使得发酵乳的pH 值略高于未添加组，说明亚硒酸钠一定程度上可能影响了菌体的生长代谢活动。郜洪涛等[11]研究表明，嗜热链球菌在发酵初期的产酸能力强，利用脱脂乳培养基中的乳糖使酸度积累，这与本研究结果一致。

2.2 不同质量浓度亚硒酸钠对发酵乳黏度的影响

从图3 可以看出，当添加亚硒酸钠质量浓度为1、2 μg/mL 时，发酵乳的黏度低于空白组，但差异不显著；其余2 组黏度显著大于空白组（P＜0.05）。嗜热链球菌在发酵过程中黏度的变化与胞外多糖的产量和酪蛋白的结构变化有关，嗜热链球菌在发酵过程中产生的胞外多糖会与蛋白质形成胶体结构，包裹乳清，进而增加发酵乳的黏度[12]。此外，pH 值的下降会使发酵乳中酪蛋白的结构稳定性发生改变，粒子发生凝聚，分子团变大，从而使发酵乳的黏度增大[13]。

2.3 不同质量浓度亚硒酸钠对发酵乳菌落数的影响

从图4 可以看出，随着亚硒酸钠质量浓度的不断增大，发酵乳中的菌落数逐渐减少，但不同质量浓度间差异不显著；在发酵24 h 后，添加亚硒酸钠的发酵乳菌落数均低于空白组，可能是由于发酵初期加硒时间过早，亚硒酸钠的存在使菌株处于毒性环境中，同时培养基中亚硒酸钠浓度的增加，使得发酵乳中无机硒的含量变高，菌株生长过程减缓[14]。PALOMO-SIGUERO 等[15]研究发现，当硒质量浓度增加到一定量时，乳酸菌的生长速度会下降，当补硒物质为亚硒酸盐时，这种现象会更为明显，这与本研究结果一致。

2.4 不同质量浓度亚硒酸钠对发酵乳抗氧化性的影响

2.4.1 对ABTS 自由基清除率的影响 ABTS 自由基是一种水溶性阳离子自由基，而ABTS 可被ABAP、MnO2、H2O2等试剂氧化，生成蓝绿色的自由基阳离子ABTS+，其在734 nm 处有最大吸收峰，在有供氢能力的抗氧化剂存在下，ABTS+与其反应，会变成没有颜色的ABTS[16]，其可广泛应用于食品抗氧化性的检测。从图5 可以看出，当添加亚硒酸钠质量浓度为2 μg/mL 时，发酵乳的ABTS 自由基清除率达到98.31%，高于其余各组，但差异不显著。在发酵乳中加入低浓度的亚硒酸钠，可提高ABTS 自由基清除率。可能是由于嗜热链球菌将一部分亚硒酸钠转化为有机硒，中和或转化了自由基物质，提高了抗氧化性；另外，随着亚硒酸钠浓度的增加，发酵乳中菌落数逐渐减少，菌体结合自由基物质能力下降，使ABTS 自由基清除率降低。

2.4.2 对DPPH 自由基清除率的影响 DPPH 自由基是一种很稳定的以氮为中心的有机自由基，其孤对电子在517 nm 波长附近有强吸收；当有抗氧化剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，溶液由紫色变为浅黄色，可通过测定反应后吸光度值评价物质抗氧化活性[17]。从图6 可以看出，当亚硒酸钠质量浓度为2 μg/mL 时，对DPPH 自由基清除率最大，为65.89%，但与其余各组间差异不显著。发酵乳中菌落数的减少，使亚硒酸钠转化为有机硒的含量降低，使得DPPH 自由基清除率降低；另外，嗜热链球菌在发酵过程中产生的胞外多糖也可作为供氢物质与自由基反应，影响DPPH 自由基链式反应，使清除率降低[18]。

2.4.3 对发酵乳总还原力的影响 还原力是反映物质抗氧化活性的一种重要指标，还原剂的存在可以提供氢电子，从而破坏自由基链发挥抗氧化作用[19]。同时，抗氧化活性与还原力呈正相关，还原能力大，则抗氧化活性就强。SHEN 等[20]研究表明，动物芽孢杆菌01 蛋白质的总还原力随着亚硒酸钠质量浓度的增加而增大，蛋白质中硒的含量越大，则其总还原力越大。由图7 可知，随着亚硒酸钠质量浓度的增大，发酵乳的总还原力也逐渐增大；当亚硒酸钠质量浓度为4 μg/mL 时，其总还原力达最大，吸光度值为0.06，但与其余各组间差异不显著。

3 结论与讨论

本研究将不同质量浓度的亚硒酸钠添加到脱脂乳培养基中，嗜热链球菌发酵24 h 后，结果显示，随着亚硒酸钠质量浓度的增大，发酵乳的滴定酸度和菌落数均有所下降，pH 值则逐渐增大；当亚硒酸钠质量浓度为 2 μg/mL 时，黏度最低，但对 ABTS 自由基清除率和DPPH 自由基清除率最大；总还原力则与亚硒酸钠质量浓度呈正相关，即质量浓度越大，发酵乳的总还原力越大。添加一定量的亚硒酸钠，发酵乳的理化性质会有所改变；但发酵乳富硒后可以为机体补硒，保证硒的摄入量，同时发酵乳本身也具有营养价值。有关富硒发酵乳的安全性等仍需进一步研究。