红肉苹果果实酚类物质含量及抗氧化性测定

吴 乾 ，王艳芳 ，蔚沐庭 ，赵惠英 ，杨廷桢 ，王 骞 ，张小军 ，高 燕 ，郝燕燕

（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.山西农业大学果树研究所，山西太谷030800）

苹果（Malus domestica Mill）.是蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）植物，属于落叶乔木，在我国已经有2 000 多年的栽培历史[1]。苹果酸甜清香，不仅含有蛋白质、糖类、有机酸、维生素和微量元素等，还含有多酚、类黄酮等功能性物质。其中，酚酸、黄酮类物质及花青素等是苹果中主要的酚类物质[2]。对蓝靛果[3]、猕猴桃[4]、杏[5]、蓝莓[6]的研究表明，酚类物质具有强的抗氧化功能，有益人类健康[7]。

“医食同源”是目前果业的发展方向，“吃营养，吃健康”已经成为人们的共识[8]。红肉苹果（Malus pumila Mill.）是新疆野苹果的一个变种，原产我国新疆伊犁地区以及中亚的哈萨克斯坦等地[9]，具有酚类物质含量高的特点。因此，有效利用新疆野苹果等种质资源，开展远缘杂交育种，进一步培育高类黄酮（红肉与红皮）苹果，对于推动我国苹果产业的优质高效发展及“健康中国”均具有重要意义[10]。

本研究以红肉苹果红满堂、红色之爱（Red Love）成熟果实为试材，以红富士为对照，测定3 个品种的总酚、总黄酮、总花青素含量以及抗氧化性，并对酚类物质含量与抗氧化性进行相关性分析，旨在筛选出高类黄酮、高抗氧化品种。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用苹果品种（图1）为红肉品种红满堂、红色之爱（Red Love），以白肉品种红富士为对照，均采摘成熟期果实。

1.2 试验方法

每个苹果品种选取5 株长势基本一致、生长发育良好的树，在树冠外围随机采取果实20 个。单株小区，5 次重复。果实通过清洗、擦干，取薄厚一致的果皮（约1.0 mm）及去核果肉，用液氮速冻后冷冻研磨仪粉碎成细粉，称质量分装，存放于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.1 酚类物质的提取 参照汪晓谦[11]的方法提取。以70%甲醇内含2%甲酸的混合溶液为提取液。提取时，称取果皮或果肉0.1 g，在0 ℃下加1 mL 提取液研磨之后再加1 mL 提取液冲洗研钵，将2 次加入的提取液并入离心管。将离心管于25 ℃、1 000 r/min 条件下振荡30 min，之后在 10 000 g 下离心10 min，取上清液待用。

1.2.2 总酚含量的测定 总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu 法[12]。在离心管中依次加入 20 μL 果实提取液、1.58 mL 蒸馏水、0.1 mL Folin-Ciocalteu试剂（1∶1 稀释），摇匀，充分反应 1 min 后加入饱和Na2CO3溶液1.5 mL，避光反应2 h。以提取溶剂为对照，用分光光度计在765 nm 波长下测定吸光度，结果以没食子酸当量（GAE）表示，单位为mg/g。

1.2.3 总黄酮含量的测定 总黄酮含量的测定采用亚硝酸钠- 硝酸铝法[13]。在离心管中依次加入0.5 mL 果实提取液、0.15 mL 5%NaNO2溶液，静置6 min 后加入0.15 mL10%A（lNO）33溶液，静置6 min后加入2 mL 4%NaOH 溶液，最后加入2.2 mL 蒸馏水，振荡混匀静置3 min 后于508 nm 下测定吸光度，结果以芦丁当量（RE）表示，单位为mg/g。

1.2.4 总花青素含量的测定 总花青素含量的测定采用pH 示差法。取果实提取液2 mL 至10 mL试管中，分别用 pH＝1.0（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl＝25∶67，V/V）、pH＝4.5（醋酸 - 醋酸钠缓冲液：取18 g 醋酸钠，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀释至1 000 mL）的缓冲液定容，反应30 min，用紫外分光光度计在510、700 nm 处测定吸光度，以矢车菊-3-葡萄糖苷表示，利用公式进行花青素含量测定，单位为mg/kg。

式中，A 为待测液花青素总吸光度；ΔApH1为pH值为1 条件下的吸光度差值；ΔApH4.5为pH 值为4.5条件下的吸光度差值；A510为待测液花青素在510 nm处的吸光度；A700为待测液花青素在700 nm 处的吸光度；c 为待测液花青素质量分数；V 为提取液总体积（mL）；DF 为稀释倍数；M 为矢车菊 -3- 葡萄糖苷的摩尔质量（449.2 g/mol）；ε 为矢车菊 -3- 葡萄糖苷的消光系数（29 600 L（/mol·cm））；m 为样品质量（g）；L 为光程（1 cm）。

1.2.5 DPPH 法测定抗氧化性 DPPH 法测定抗氧化活性参照ZHANG 等[14]的方法。用无水乙醇溶解DPPH，使溶液的物质的量浓度达到0.1 mmol/L，配制完成后置于包裹锡箔纸的烧瓶中，4 ℃暗保存。测定时取0.1 mL 待测样品，加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液，充分振荡 30 s，暗反应 30 min 之后，于517 nm 处测定吸光度。

绘制抗坏血酸的自由基清除率相对于其浓度的标准曲线。DPPH 抗氧化活性单位为mg/100 g。

1.2.6 FRAP 法测定抗氧化性 FRAP 法测定抗氧化活性参照ZHANG 等[14]的方法。FRAP 储备液由300 mmol/L 乙酸钠缓冲液（3.1 g C2H3NaO2·3H2O＋16 mL C2H4O2，pH＝3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（溶于40 mmol/L HCl） 以及 20 mmol/L FeCl3·6H2O 这 3 种溶液按照10∶1∶1 的体积比混合而成，现用现配。测定时，取20 μL 果实提取液加入1 mL 水与2 mL FRAP 储备液，充分混合，于37 ℃反应10 min 后，在593 nm 处测定吸光度。

绘制以水溶性维生素E（Trolox）为标样的标准曲线。样品的FRAP 抗氧化活性单位为mg/100 g。

1.2.7 ABTS 法测定抗氧化性 ABTS 法测定抗氧化活性参照AMIR 等[15]的方法，略有改动。ABTS·+储备液由5 mL7 mmol/LABTS 溶液和5 mL2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合之后，于室温暗反应12 h 后制成。测定时用乙醇稀释ABTS+·储备液，于734 nm 处测得0.70±0.02 的吸光度。之后将50 μL 果实提取液与4 mL 乙醇稀释后的ABTS+·储备液混合，避光反应6 min 后于734 nm 处测定吸光度。样品的ABTS抗氧化性单位为mg/100 g。

1.3 数据处理与分析

试验结果以平均值±标准差表示。使用Origin 2018 制图，运用SAS 8.1 软件对所得数据进行显著性差异分析，运用SPSS 21 软件中Pearson 函数对总酚含量、总黄酮含量、总花青素含量与以DPPH法、FRAP 法、ABTS 法测定的抗氧化性之间的相关性进行计算。

2 结果与分析

2.1 红肉苹果果实酚类物质含量分析

由图2-A 可知，红满堂果皮总酚含量最高，为9 899.99 mg/kg，极显著高于红色之爱（8 474.12 mg/kg）和红富士（7 563.81 mg/kg）；红满堂果肉总酚含量最高，为4 124.74 mg/kg，极显著高于红色之爱（3 614.01 mg/kg）和红富士（2 627.64 mg/kg）。

从图2-B 可以看出，红满堂果皮总黄酮含量最高，为39 459.77 mg/kg，极显著高于红色之爱（25 546.51 mg/kg）和红富士（21 022.64 mg/kg）；红满堂果肉总黄酮含量最高，为15 455.34 mg/kg，极显著高于红色之爱（11 486.47 mg/kg）和红富士（7 697.58 mg/kg）。

从图2-C 可以看出，红满堂果皮总花青素含量最高，为499.68 mg/kg，极显著高于红色之爱（271.19 mg/kg）和红富士（201.67 mg/kg）；红满堂果肉总花青素含量最高，为135.37 mg/kg，极显著高于红色之爱（58.88 mg/kg）和红富士（35.98 mg/kg）。

3 个品种总酚、总黄酮、总花青素含量均表现为果皮显著高于果肉。

2.2 红肉苹果果实抗氧化性分析

由图3-A 可知，红满堂果皮DPPH 自由基清除能力最强（510.47 mg/100 g），极显著高于红色之爱（318.51 mg/100 g）和红富士（170.59 mg/100 g）；红满堂果肉DPPH 自由基清除能力最强（439.04mg/100g），极显著高于红色之爱（248.37 mg/100 g）和红富士（71.94 mg/100 g）。

由图3-B 可知，红满堂果皮FRAP 抗氧化能力最强，为381.39 mg/100 g，极显著高于红色之爱（303.60 mg/100 g）和红富士（108.80 mg/100 g）；红满堂果肉FRAP 抗氧化能力最强，为238.51 mg/100 g，极显著高于红色之爱（89.55 mg/100 g）和红富士（52.65 mg/100 g）。

由图3-C 可知，红满堂果皮ABTS+·自由基清除能力最强，为581.61 mg/100 g，极显著高于红色之爱（515.33 mg/100 g）和红富士（214.12 mg/100 g）；红满堂果肉ABTS+·自由基清除能力最强，为365.29mg/100g，极显著高于红色之爱（244.51 mg/100 g）和红富士（143.82 mg/100 g）。

3 个品种DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力、ABTS·+自由基清除能力都表现为果皮显著高于果肉。

2.3 果实酚类物质含量与抗氧化性的相关性分析

对果实酚类物质（总酚、总黄酮、总花青素）含量与抗氧化性（DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力）进行相关性分析，结果如图4 所示，果皮中总酚、总黄酮和总花青素含量都与DPPH 自由基清除能力呈极显著正相关；果皮中总酚与FRAP 抗氧化能力呈显著正相关，总黄酮、总花青素与FRAP 抗氧化能力不存在显著相关性；果皮中总酚含量与ABTS+·自由基清除能力呈极显著正相关，总黄酮、总花青素与ABTS+·自由基清除能力呈显著正相关。

果肉中总酚、总黄酮、总花青素含量与3 个抗氧化指标均呈极显著正相关。

3 结论与讨论

HU 等[16]对苹果果实酚类物质研究表明，苹果属植物在不同组织中，其含量具有显著差异。HOLDERBAUM等[7]对苹果酚类物质分布的研究发现，苹果果皮中总酚含量大于果肉中含量。本研究结果表明，红肉苹果红满堂果实中酚类物质含量极显著高于红色之爱和红富士，且3 个品种果皮中酚类物质含量均显著高于果肉中含量，这一结果与前人研究结论一致。

本试验对苹果果实DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化（铁离子还原）能力以及ABTS+·自由基清除能力进行分析，结果表明，红肉苹果红满堂、红色之爱果实的DPPH 自由基、ABTS+·自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力极显著高于红富士，且红满堂极显著高于红色之爱。前人研究的结果表明，苹果抗氧化性与苹果酚类物质组成及含量密切相关，酚类物质越丰富，苹果的抗氧化性越强[17]。本研究通过对果实酚类物质（总酚、总黄酮、总花青素）含量与抗氧化性（DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力）进行相关性分析的结果也支持了此结果。红满堂果实高的酚类物质含量及其高的抗氧化性，说明红满堂可作为加工型高酚类品种进行开发利用。红满堂是以舞美、山定子为亲本杂交选育出的新型红肉品种，其果实自幼果期直至成熟期均为紫红色，果汁呈血红色[18]，果肉不易褐变，可做天然药妆品。本研究进一步为红满堂的开发利用提供了理论支撑。