凤冈绿茶中原花青素的提取工艺优化

卢利平,张 利,李 铀,*,金伟嘉,丁功涛,高丹丹,陈士恩(.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;.西北民族大学生物医学研究中心中国马来西亚国家联合实验室,甘肃兰州 730030)

原花青素(Procyanidins,PC)主要是由不同数目的儿茶素及其衍生物等缩合而成的多酚化合物,亦是一种生物类黄酮混合物,红棕色粉末状,气味微苦涩,能溶于水和大多数有机溶剂[1]。原花青素具有抗氧化活性[2]、抗肿瘤[3]、抗辐射[4]、防治心血管疾病[5]等多种功能,在药品、食品、化妆品等领域应用比较广泛[6-7]。原花青素的提取方法有多种,最常用的方法有溶剂萃取法[8]、酶法提取法[9-11]、超声波辅助提取法[12-13]、高效液相色谱法[14]、低浓度香草醛-盐酸法[15]、紫外分光光度法、铁盐催化法等[16]。

目前国内外的研究者大多是针对茄子[8]、葡萄[17-18]、黑果枸杞[19-20]、山楂[21-22]、香蕉[23]等植物中的原花青素进行研究,对茶中原花青素的研究还相对较少[24-25],关于凤冈绿茶中原花青素提取与检测未见报道,由此可见,对武陵山片区茶叶中原花青素的测定与分析很有必要,可以增加片区茶叶的附加值和山区茶农的经济来源,为进一步开发利用茶叶和脱贫攻坚工作起到一定推动作用。赵春艳等[26]实验结果表明超声辅助法优于溶剂提取法。因此,本课题以凤冈绿茶为原料,在低浓度香草醛—盐酸法[15]基础上,考察乙醇浓度、超声温度、超声时间、料液比等因素对原花青素得率的影响,响应面优化超声波辅助提取原花青素的工艺条件,得出最佳提取工艺,为凤冈绿茶中原花青素的进一步综合开发与利用提供有利的科学支撑,为进一步开发凤冈绿茶的产品附加值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凤冈绿茶 贵州省凤冈县娄山春茶叶专业合作社;蒸馏水、甲醇、无水乙醇、香草醛、浓盐酸、石油醚(均为分析纯) 兰州市奥科生物技术有限公司;原花青素标准品 Sigma公司。

KQ2200DE超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司;H1650-W离心机 湘仪离心机仪器有限公司;Dor Yang DA型电子分析天平 渡扬精密仪器(上海)有限公司;BWS-0505型恒温水槽水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;WJX-200型高速多功能粉碎机 上海缘沃工贸有限公司;UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 凤冈绿茶原花青素提取工艺流程 凤冈绿茶→粉碎(过80目筛)→超声提取→离心→原花青素提取液

1.2.2 茶样品溶液前处理 称取一定质量的凤冈绿茶,用粉碎机粉碎(过80目筛),置于比色管中,按一定料液比加入一定体积分数的乙醇,盖好盖子,在超声频率40 kHz,一定温度条件下,提取一定时间。提取结束后,过滤收集上清液,提取两次后合并上清液并在12000 r/min离心10 min,取上清液定容至50 mL,作为提取液。

1.2.3 原花青素含量的测定 原花青素含量的测定采用改良的浓盐酸-香草醛法[15],分别配制1%香草醛-甲醇溶液及1 mol/L盐酸-甲醇溶液,按照体积比1∶1充分混匀得到反应工作液。

1.2.3.1 原花青素标准曲线的绘制 准确称取原花青素标准品25 mg,置于25 mL具塞试管中,加入甲醇混合均匀后定容至刻度线,得到1 mg/mL的原花青素标准品储备液。准确吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的上述标准溶液,置于10 mL具塞试管中,加入3 mL反应工作液,甲醇定容至刻度,混匀后放入30 ℃恒温水浴锅中,避光反应1 h,取出静置至室温,甲醇调零作为空白对照,于500 nm波长处测定其吸光度(A500)值[27]。

1.2.3.2 样品中原花青素含量的测定 准确移取1 mL样品提取液于10 mL具塞试管中,加入3 mL反应工作液,甲醇定容至刻度,混匀后按照上述方法进行反应,反应结束后在波长500 nm处测定其吸光(A500)值,根据标准曲线计算凤岗绿茶中原花青素浓度,并计算原花青素的得率[20]。

式中:C表示测得的原花青素浓度,mg/mL;V表示茶样品定容体积,mL;f表示稀释倍数;m表示茶样品质量,g。

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 乙醇浓度对原花青素得率的影响 在控制料液比为1∶20 g/mL,超声温度为70 ℃、超声时间为50 min,乙醇浓度(乙醇与水的混合溶液)分别为70%、75%、80%、85%、90%、95%的条件下,考察乙醇浓度对凤冈绿茶原花青素得率的影响。

1.2.4.2 超声温度对原花青素得率的影响 在料液比为1∶20 g/mL,乙醇浓度为85%,超声时间为50 min,超声温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃的条件下,考察超声温度对凤冈绿茶原花青素得率的影响。

1.2.4.3 超声时间对原花青素得率的影响 在料液比为1∶20 g/mL,乙醇浓度为85%,超声温度分别为50 ℃,浸提时间分别为30、40、50、60、70、80 min的条件下,考察超声时间对凤冈绿茶原花青素得率的影响。

1.2.4.4 料液比对原花青素得率的影响 在乙醇浓度为85%,超声温度分别为50 ℃,浸提时间为40 min,料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL的条件下,考察料液比对凤冈绿茶原花青素得率的影响。

1.2.5 响应面优化试验 根据Box-Behnken设计原理,在单因素试验的基础上,工艺优化选取对凤冈绿茶原花青素得率有显著影响的乙醇浓度(A)、超声温度(B)、超声时间(C)、料液比(D)4个因素作为自变量,以凤冈绿茶原花青素得率为响应值,进行四因素三水平的响应面分析实验,优化原花青素的提取工艺,试验因素和水平设计如表1所示。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 数据处理

每组实验做3次平行,结果取平均值;采用Office Excel 2003软件进行数据分析;采用Origin 8.0制图;Design-Expert 8.06软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与讨论

2.1 原花青素标准曲线的绘制

以原花青素标准品浓度为横坐标(X),吸光度(A500)值为纵坐标(Y),绘制标准曲线,如图1所示。求得标准曲线方程为:Y=1.615X-0.0014,相关系数R2=0.9991,且在0.1～0.6 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 The standard curve of proanthocyanins

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对原花青素得率的影响 由图2可知,随乙醇浓度的提高,总原花青素得率呈现先升高后下降趋势,当乙醇浓度为85%时,原花青素得率最高;乙醇浓度大于85%时,原花青素得率开始下降。这是由于不同浓度的乙醇具有不同的极性,对原花青素的溶出量有一定的影响,这与原花青素本身的极性相关。同时,随着乙醇浓度增大,脂溶性成分溶出,同原花青素形成竞争关系,导致原花青素得率下降[23]。根据单因素实验结果及曲线变化规律,在Box-Behnken中心组实验设计中,乙醇浓度选取80%～90%。

图2 乙醇浓度对原花青素得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanins

2.2.2 超声温度对原花青素得率的影响 由图3可知,在超声温度20～50 ℃范围内,原花青素得率随着超声温度的升高而增大,温度继续升高超过50 ℃后,凤冈绿茶原花青素得率呈下降趋势。这是因为适当的高温能够促进原花青素的溶出,但是温度过高使原花青素的结构被破坏,同时也会增加其他杂质的溶出量,因而原花青素的得率会降低[27]。根据单因素实验结果及曲线变化规律,在Box-Behnken中心组实验设计中,超声温度选取50～70 ℃。

图3 超声温度对原花青素得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of proanthocyanins

2.2.3 超声时间对原花青素得率的影响 由图4可知,凤冈绿茶原花青素得率呈先增加后减少的变化趋势。在30～40 min范围内,随着超声时间的延长,原花青素得率不断上升;当超声时间为40 min时,原花青素得率达到最大值;超过40 min后,原花青素得率随时间延长开始逐渐下降。这是由于时间过短,原花青素提取不够充分,时间过长导致原花青素酚羟基机构破坏,影响得率[28]。为了提高原花青素得率,根据单因素实验结果及曲线变化规律,在Box-Behnken中心组实验设计中,超声时间选取30～50 min。

图4 超声时间对原花青素得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of proanthocyanins

2.2.4 料液比对原花青素得率的影响 由图5可知,凤冈绿茶中原花青素得率随着料液比的增加而升高,当料液比超过1∶30 g/mL后,原花青素得率变化较小。这是由于当浸提溶剂量比较小时,凤冈绿茶中原花青素溶出不彻底;随着溶剂量增加,原花青素得率先增大后基本趋于平衡状态,根据单因素实验结果及曲线变化规律,在Box-Behnken中心组实验设计中,料液比选取1∶30～1∶40 g/mL范围。

图5 料液比对原花青素得率的影响Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the yield of proanthocyanins

2.3 响应面设计结果与分析

2.3.1 响应面法优化原花青素提取工艺 根据单因素实验结果,通过Design-Expert 8.06软件设计,以乙醇浓度(A)、超声温度(B)、超声时间(C)、料液比(D)为自变量,以凤冈绿茶中原花青素得率为响应值,根据四因素三水平的中心组合实验设计29个试验点进行响应面分析,其中5、8、10、11、12是中心试验,其余为析因试验。响应面试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面设计方案及结果 Table 2 Scheme and results of response surface design

2.3.2 模型的建立与显著性分析 通过Design-Expert 8.06软件进行多元回归分析,得到凤冈绿茶提取液的乙醇浓度、超声温度、超声时间、料液比四因子数学回归方程为:

Y=4.73-0.36A-0.15B-0.024C-0.004D-0.042AB-0.018AC+0.15AD+0.025BC-0.035BD-0.037CD-0.56A2-0.32B2-0.16C2-0.073D2。

表3 回归方程方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

综上所述,此模型可以用来分析和预测凤冈绿茶中原花青素得率的真实情况。由F值可知,各因素对原花青素得率的影响次序为A>B>C>D,即乙醇浓度>超声温度>超声时间>料液比。

2.3.3 响应面交互作用分析 响应面曲面图可以直观反映乙醇浓度、超声温度、超声时间和料液比对原花青素得率的影响,如图6～图11所示。对比图6～图11,乙醇浓度对原花青素得率的影响最大,其次是超声温度、超声时间,料液比响应面相对平缓,说明其对原花青素得率的影响最小。交互效应强弱程度可以从投影面的等高线形状中观察,圆形为交互作用不显著,椭圆则为交互作用显著[28]。从图8a中可以看出,曲面倾斜度比较大,而且越是靠近曲面顶端,颜色越深,表示乙醇浓度与料液比的交互作用显著,其余各因素等高线椭圆形状不明显(图6～图7、图9～图11),表明其交互作用不显著,这与回归方程的方差分析结果一致。

图6 乙醇浓度与超声温度对原花青素得率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots of ultrasonic temperature and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

图7 乙醇浓度与超声时间对原花青素得率影响的响应面图Fig.7 Response surface plots of ultrasonic time and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

图8 乙醇浓度与料液比对原花青素得率影响的响应面图Fig.8 Response surface plots of material-liquid ratio and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

图9 超声时间与超声温度对原花青素得率影响的响应面图Fig.9 Response surface plots of ultrasonic time and temperature on the proanthocyanin extraction rate

图10 超声温度与料液比对原花青素得率影响的响应面图Fig.10 Response surface plots of ultrasonic temperature and material-liquid ratio on the proanthocyanin extraction rate

图11 超声时间与料液比对原花青素得率影响的响应面图Fig.11 Response surface plots of ultrasonic time and material-liquid ratio on the proanthocyanin extraction rate

2.3.4 最佳提取工艺条件及验证试验 对回归方程进行求解,即得率达到最大值时的提取条件为:乙醇浓度83.2%,提取温度58.1 ℃,提取时间 39.7 min,料液比 1∶33.25 g/mL,在此条件下,原花青素得率为4.804%。根据实际情况,对工艺条件进行调整,调整后的最佳提取条件为:乙醇浓度83%,提取温度58 ℃,提取时间40 min。料液比1∶33 g/mL;为进一步确定响应面法优化结果的准确性,在调整后的工艺条件下做3次重复试验验证,得到凤冈绿茶中原花青素得率为4.798%±0.05%。结果表明,经过回归方程拟合出的理论值与实际值的RSD值为1.05%,说明用响应面法优化凤冈绿茶原花青素的提取工艺条件具有可行性。

3 结论

采用响应面分析法对凤冈绿茶中原花青素进行超声辅助提取工艺优化,拟合了乙醇浓度、超声温度、超声时间和料液比四个因素对凤冈绿茶中原花青素得率影响的回归模型,分析结果得到四因素对原花青素得率的影响大小次序为:乙醇浓度>超声温度>超声时间>料液比。优化后的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度83%,提取温度58 ℃,提取时间40 min。料液比1∶33 g/mL。在此条件下,凤冈绿茶中原花青素得率为4.798%±0.05%,高于黑果枸杞中原花青素得率[20],与预测值(4.804%)相近,且其相对误差为1.05%,说明响应面优化后的工艺条件可行。采用超声辅助提取凤冈绿茶中原花青素,操作简单,得率高,为凤冈绿茶中原花青素的进一步开发利用提供依据。