母树年龄、留叶方式和基质对千年桐扦插生根的影响

周幼成，钟秋平，邹玉玲，田 丰，葛晓宁，曹林青，王金凤

（中国林业科学研究院亚热带林业实验中心，江西分宜 336600）

【研究意义】千年桐（Vernicia montana）为大戟科（Euphorbiaceae）油桐属（Vernicia）落叶乔木，是我国重要的工业油料树种，与乌桕、核桃和油茶并称为中国四大木本油料树种[1-2]。千年桐种仁含油率达到50%以上，桐油含有较高的不饱和脂肪酸，且具有耐高温酸碱、绝缘、附着力强、抗冻裂、防水等优点，是一种绿色无公害的优质干性油，常作为涂料用于船舶、家具、半导体等以及汽车的制造[3-5]。研究发现，桐油有望开发成为优质的生物柴油，目前，工业能源日趋减少，恢复生态环境已迫在眉睫，千年桐产业的发展或可为缓解国家资源紧张做出一定贡献[6]。千年桐在利用种子萌发的实生苗进行生产造林时，实生苗生长成林所需周期长，投入成本高，且实生苗易产生遗传变异不能很好地保持亲本优良性状，在一定程度上限制了千年桐产业的发展。无性扦插繁殖能够高度保持母本优良性状，而且具有操作简单、成苗快、应用广泛等优点，是许多木本树种快速繁殖的方法之一。

【前人研究进展】目前，关于千年桐扦插繁殖及生根机理研究进展缓慢[7]，何锐等[8]对大戟科树种麻疯树（Jatropha curcasL.）进行扦插繁殖研究时发现，麻疯树穗条长度、外源激素种类、浓度及处理时间可以显著影响插穗生根，其中穗条长度为主要影响因素，其次为激素浓度和处理时间；崔永忠等[9]发现不同长度、不同品种的麻疯树穗条对扦插生根及成活有一定影响，质量浓度为100～300 mg/L ABT处理可以显著提高插穗成活率、发根数。【本研究切入点】【拟解决的关键问题】采用3 因素3 水平L9（34）正交试验设计，探究母树年龄、留叶方式和基质对千年桐扦插生根的影响，通过调查不同处理生根指标，确定扦插生根的最佳处理组合以及相对应的环境条件；探究留叶方式对千年桐插穗生根过程根系性状和生理的影响，通过对不同留叶方式插穗生根过程进行形态学、解剖学和生理学研究，探究其不定根形成的组织起源和生根类型，了解不同留叶方式插穗生根周期和生根方式的差异，同时，明确内源激素和相关营养物质与插穗愈伤组织和不定根形成之间的响应机制，为千年桐扦插快繁及引种驯化提供科学理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于中国林科院亚林中心的试验大棚中进行（27°48′40″N，114°39′37″E），大棚具有自动化喷雾等设施，苗床用黄泥土和少量河沙填充，四周用砖块砌实，上方3.5 m处覆盖遮阳网。当地气候类型为亚热带季风性湿润气候，土壤为红壤，年均降水量约为1 650 mm，平均海拔82 m，年均气温15.60 ℃，极端高温为40.2 ℃，全年无霜期约为265 d。

1.2 试验设计

千年桐叶片聚生于枝顶，顶端优势明显，顶芽抑制侧芽的生长，预试验发现不带有新生芽和叶片的插穗难以生根，需要对枝条进行不同留叶处理。插穗均采自千年桐良种示范林的半木质化春梢，将插穗剪为8～10 cm 每段，用500 mg/L 的ABT-1 溶液浸泡30 min。（1）探究母树年龄、留叶方式和基质对扦插生根的影响，采用3因素3水平L9（34）正交试验设计，试验设计组合见表1。留叶方式有3种，方式L1保留顶芽和1 片叶，方式L2仅保留顶芽，方式L3去除顶芽保留新生侧芽；扦插基质有3 种，基质S1为V（河沙）∶V（泥炭）=1∶1，基质S2为V（河沙）∶V（黄泥土）=1∶1，基质S3为V（黄泥土）∶V（木屑）=1∶1，共9 个处理，每个处理选择100 株插穗，重复3 次。扦插35 d 后调查愈伤率，63 d 后调查各组生根率、根长等生长性状指标。（2）探究留叶方式对千年桐插穗生根过程根系性状和生理的影响，将3 种不同留叶方式L1、L2和L3的插穗，扦插于河沙与黄心土同体积比的混合基质中，共3 个处理，每个处理150株插穗，重复3 次，对生根过程进行拍照和显微观察，同时检测顶芽、侧芽和叶片相关生理指标。

表1 正交试验设计方案Tab.1 Orthogonal design plan

1.3 扦插及管理

试验于2019 年3 月初开始，选用高约15 cm、直径约6 cm 的无纺布袋盛放扦插基质，扦插前2 d 基质用0.5%高锰酸钾溶液消毒后用托盘整齐地摆放在苗床上。插穗下端剪出平滑斜切面，用0.1%的多菌灵水溶液对插穗消毒10～15 min，清洗后将插穗下端浸泡于500 mg/L 的ABT-1溶液中30 min。扦插前需要用竹签在基质上打出约6 cm 深的引导洞，扦插时为了使基质与插穗紧密贴合需要用手压实插穗周围基质后浇透水。适时喷雾保持插穗及土壤湿润，用喷雾器对插穗交替进行喷雾消毒，消毒剂为0.1%的多菌灵溶液和0.1%的高锰酸钾溶液，及时清除枯落叶和坏死插穗，前期每5 d 消毒1 次，生根后每周消毒1次。

1.4 数据调查

（1）正交试验数据调查。扦插35 d后统计插穗愈伤率。扦插63 d后，调查一级不定根的数量并测量根长，然后将根系杀青，放于60 ℃恒温箱中烘烤20 h后称量，精度为0.01 g。计算根系效果指数=（根系数量×平均根长）/插穗总数；对生根数、根系干质量等指标进行隶属函数计算，隶属函数为：R（Y）=（Y-Ymin）/（Ymax-Ymin），Y为不同处理的指标测定值，Ymin和Ymax为某一指标在所有处理中的最小值和最大值，对不同处理进行排名评价。

（2）不同留叶方式插穗根系生长和生理指标调查。扦插后每周拍照观察插穗生根情况，方法为抽取不同留叶方式的插穗，洗净置于工作台上进行拍照，并截取长约1 cm 基部茎段，保存于FAA 固定液中用于根系解剖结构观察研究，参照周乃富等[10]研究方法对样品固定软化，染色液为番红-固绿，Olympus BX51显微镜观察拍照。取扦插0，21，42，63 d时的样品，截取插穗顶芽、侧芽和叶片，采用安捷伦1260高效液相色谱仪串联6420A 质谱仪测定内源IAA，ZR，ABA 和GA3含量，硫酸蒽酮法测定可溶性糖含量[11]，考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量[12]。

1.5 数据分析

采用SPSS 20.0和Excel 2016软件对数据进行统计及方差分析，对有显著性差异的指标进行Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 母树年龄、留叶方式和基质对千年桐插穗生根的影响

2.1.1 不同处理间根系生长指标比较 扦插35 d后统计愈伤组织率，63 d后统计生根率、生根数等根系生长指标，结果如表2所示。不同处理间根系生长性状差异明显，插穗愈伤率范围为31.67%～68.17%，最长根长范围为14.16～9.37cm，最高值出现在P1，最低值出现在P9；生根率范围为26.63%～45.31%，根系干质量范围为0.087～0.160 g，根系效果指数范围为1.19～2.72，最大值皆出现在P1，最小值皆出现在P6；生根数范围为6.67～9.67 条，最大值出现在P3，平均根长范围为4.02～6.01 cm，最大值出现在P1，其最小值皆出现在P7。P1选取1 年生插穗保留顶芽和1 片叶扦插于河沙+泥炭（1:1）混合基质，其愈伤率、生根率、平均根长、最长根长、根系干质量和根系效果指数均达到最高值，根系总体生长情况明显优于其他处理。生根数和最长根长在不同处理间差异不明显。

表2 母树年龄、留叶方式及基质对千年桐插穗生根的影响Tab.2 Effects of the mother tree age，leaf retention and substrates on rooting ofVernicia montanacuttings

2.1.2 不同处理根系生长指标差异分析 对根系生长性状指标进行方差分析，结果如表3所示。母树年龄对愈伤率、平均根长和根系效果指数有极显著影响（P<0.01），对生根率和根系干质量有显著影响（P<0.05）。留叶方式对愈伤率、生根率、根系干质量和根系效果指数有极显著影响，对最长根长有显著影响。母树年龄对插穗愈伤率的影响高于留叶方式，但对生根率的影响低于留叶方式。扦插基质对插穗根系生长影响不显著。

由表3 可知，母树年龄和留叶方式对生根有显著影响，对两种因素不同水平间的根系生长指标进行多重比较，结果如表4 所示。插穗的愈伤率、生根率、生根数和根系效果指数随着母树年龄的增加呈降低趋势，即1 年生插穗>3 年生插穗>5 年生插穗，母树年龄越高其根系生长愈差，1 年生插穗的愈伤率、生根率、平均根长和根系效果指数均显著高于5 年生插穗（P<0.05）。保留顶芽和1 片叶（L1）的插穗，其愈伤率、生根率、最长根长、根系干质量和根系效果指数皆高于仅保留顶芽（L2）和仅保留侧芽（L3）的插穗，其中L1的平均根长、根系干质量和根系效果指数均显著高于L2和L3，L1和L2的愈伤率和生根率显著高于L3（P<0.05），不定根总体生长规律为L1>L2>L3。

表3 不同处理对根系生长性状指标影响的方差分析Tab.3 Variance analysis of the effects of root growth characters indexes in different treatments

表4 母树年龄和留叶方式和对千年桐插穗根系生长影响的LSD多重比较Tab.4 LSD multiple comparison of the effects of the mother tree age and leaf retention on cutting rooting pa⁃rameters ofVernicia montana

2.1.3 根系发育指标的隶属函数值及综合评价 采用模糊数学中的隶属函数分析法对千年桐不定根生长性状指标进行分析，根据隶属函数值，对不同处理生根指标进行综合排名。结果如表5所示，最佳处理组合P1选取1 年生插穗保留顶芽和1 片叶，其平均隶属函数值最高为0.949，P4选取3 年生插穗保留顶芽和一片叶，其平均隶属函数值为0.692，略高于1 年生母树插穗P2和P3，P6选取3 年生插穗仅保留侧芽，P9选取5年生插穗仅保留侧芽，其隶属函数值最低分别为0.211和0.081。

表5 根系生长指标隶属函数值及综合评价Tab.5 Membership function values and synthetic valuation of root development indicators

2.2 留叶方式对千年桐插穗生根过程根系性状和生理的影响

2.2.1 不同留叶方式的插穗生根形态观察 对扦插0，21，42，63 d 3 种留叶方式的插穗取样进行拍照观察，对比分析发现，（1）扦插0 d，不同留叶方式插穗生长状态相同，叶片及茎段呈鲜绿色（图l a，e，i）；（2）扦插21 d，L1处理切口开始愈合，基部产生较多愈伤组织（图l b），L2和L3产生的愈伤组织较少（图l f，j）；（3）扦插42 d，各处理基部愈伤组织比前期明显增多，同时形成了不定根，且L1处理不定根生长状况显著优于L2和L3（图l c，g，k）；（4）扦插63 d 以后，不定根较前期伸长增粗，根系数量明显增加，各处理间根系生长差异明显，L1处理根系及插穗生长情况最优（图1 d，h，l）。

图1 千年桐不同留叶方式插穗根系生长差异对比Fig.1 Comparison of root growth differences of different leaf retention cuttings ofVernicia montana

2.2.2 不同留叶方式的插穗解剖结构显微观察对扦插14，28，35，42 d 3种留叶方式的插穗根系解剖结构进行显微观察，对比分析发现，（1）扦插21 d，L1薄壁细胞出现了明显的分裂分化，并开始向外产生类分生组织，形成排列紧密与周围细胞有明显区别的细胞团，即形成了根原基（图2 a），L2和L3插穗维管形成层和韧皮部发现了开始分裂的根原始细胞，但此时形成层细胞刚刚恢复分生能力，周围组织生长分化并不明显（图2 e，i）；（2）扦插28 d，L1根原基细胞团通过平周分裂和垂周分裂等，其形态发生了巨大变化，由开始的卵圆形变为楔形，并朝着皮部延伸（图2 b），L2和L3插穗薄壁细胞也出现了明显的分裂分化，形成了排列紧密与周围细胞有明显区别的细胞团，L2根原基分化优于L3（图2 f，j）；（3）扦插35 d，L1根原基继续朝着韧皮部射线的方向生长，延伸到皮层区域，此时根原基可以区分出根冠、根尖和分生区，最外层表皮被不定根所突破（图2 c），L2和L3根原基进行快速分裂分化，其形态发生了巨大变化，并朝着韧皮部射线的方向生长，延伸到皮层区域（图2 g，k）；（4）扦插42 d，L1和L2根冠区域逐渐分化出维管组织，与插穗的维管系统相连形成完整的根结构（图2 d，h），L3根原基生长延伸到皮层区域，可以区分出根冠、根尖和分生区，最外层表皮被不定根所突破。

图2 千年桐不同留叶方式的插穗解剖结构变化Fig.2 Anatomical changes of the different leaf retention cuttings ofVernicia montana

2.2.3 留叶方式对插穗内源激素含量的影响测定不同留叶方式插穗生根过程顶芽、侧芽内源激素含量变化，结果如图3所示。不同处理生长素（IAA）含量变化趋势大致相同，前期快速下降，扦插21 d降到最低值，生根之后其含量缓慢增加，扦插63 d，L1和L2处理IAA 含量逐渐接近扦插0 d 时的水平。玉米素核苷（ZR）含量总体变化为前期快速下降，后期缓慢上升，不同留叶方式的插穗ZR含量变化存在差异，L1和L2处理前期其含量一直呈下降趋势，扦插42 d即不定根快速生长阶段，其含量开始上升，L3处理ZR 含量呈现一定的波动。赤霉素（GA3）含量水平远低于IAA 和ZR，含量总体呈上升趋势，L1和L2的GA3含量含量前期下降，扦插21 d后含量逐渐上升，L3含量始终处于上升趋势。不同处理脱落酸（ABA）含量总体变化趋势相似，前期愈伤组织形成期ABA 含量快速上升，L1和L2处理扦插42 d 即不定根生长阶段ABA 含量开始缓慢下降，L3处理ABA含量呈现一定波动，但始终保持较高水平。

图3 留叶方式对千年桐插穗内源激素含量的影响Fig.3 Effects of leaf retention on endogenous hormones of theVernicia montanacutting

2.2.4 留叶方式对插穗可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响测定不同留叶方式的插穗生根过程叶片内可溶性蛋白含量、可溶性糖含量变化，结果如图4所示。不同处理间可溶性糖含量变化规律大致相同，留叶方式L2和L3扦插前期可溶性蛋白含量略微下降，之后呈增长趋势，L1叶片中可溶性蛋白含量前中期呈增长趋势，扦插42 d 其含量略微下降，但高于扦插0 d 时的水平。不同留叶方式的插穗可溶性糖含量变化规律存在差异，L2可溶性糖含量前期降低，扦插42 d 时即不定根快速生长阶段时其含量达到最高值，后呈下降趋势，L1可溶性含量呈现一定波动，但范围较小，且含量始终保持较高水平，L3可溶性糖含量前中期始终缓慢下降，扦插42 d后即不定根快速生长阶段，其含量开始上升趋于扦插0 d的水平。

图4 留叶方式对千年桐插穗可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响Fig.4 Effects of leaf retention on the content of soluble protein and soluble sugar ofVernicia Montanacutting

3 结论与讨论

插穗生根过程与自身遗传特性、生态学、生物学密切相关，同时受外界多种因素共同调控，是一个极其复杂的生理过程[13]。母树年龄与不定根生成之间关系密切，插穗母树年龄越大其木质化程度越高，营养物质含有量和含水量相对较低，不利于不定根的产生[14]。千年桐插穗生根过程也呈现了上述规律，即1 年生插穗>3 年生插穗>5 年生插穗，1 年生插穗根系生长情况显著优于5 年生插穗（P<0.05）。白磊等[15]对米老排扦插生根研究中发现，1 年生插穗生根率可达到81.7%，极显著高于5 年生插穗约5.0%的生根率（P<0.01）；秦爱丽等[13]研究发现，母树年龄越小，插穗生根效果越好。扦插基质对插穗生根有重要影响，基质成分决定其理化性质差异较大，最佳的扦插基质应该具有保水、通气和提供养分等作用[16-18]。干净的河沙具有一定的通气性、保温性；泥炭具有丰富的营养物质，有助于改善土壤结；黄泥土不易滋生细菌，保水性较好，但通气性较差；木屑具有一定的通气保温作用，但保水性较差，容易滋生细菌。研究发现，千年桐插穗在不同基质中根系生长差异不显著，可能是本次研究的基质组成过于简单，亦或与千年桐扦插生根对基质的要求有关，有待于进一步深入研究。

千年桐插穗保留顶芽和一定数量的叶片有助于其生根，留叶方式L1插穗生根情况显著优于L2和L3。对不同留叶方式的插穗生根过程进行拍照和显微观察，发现在同一时期，L1的不定根形成及根原基细胞的诱导分化明显快于L2和L3，L1插穗能更快速地对外界植物生长调节剂产生响应，其生根速率和生根数量也显著高于L2和L3。对不同处理相关生理指标进行检测发现，其叶片、顶芽及侧芽的内源激素、可溶性蛋白和可溶性糖含量存在一定差异，且随着不定根的生长不断变化。叶片和顶芽可以产生光合作用为插穗提供有机营养，同时，叶片的蒸腾作用带动了插穗内物质运输促进生根，老叶为根系生长发育提供了75%的养分，生根所需的碳水化合物和内源激素主要来源于叶片[20-24]。不同留叶方式插穗IAA 含量变化趋势大致相同，前期快速下降，生根后含量缓慢增加，扦插63 d，IAA 含量与插穗生根率呈极显著正相关。研究发现IAA 在不定根生成过程中起着重要作用，主要作用于受体蛋白后通过转运糖类等物质来促进根原始细胞的分裂生长[25]。ZR 在不同生根时期作用不同，ZR 在根原始细胞分裂分化及愈伤组织形成过程中有所消耗，在不定根长出后，通过自身合成作用使其含量增加[26-27]，这与千年桐扦插生根研究结果相一致。千年桐插穗GA3含量水平远低于IAA 和ZR，含量总体呈上升趋势。研究发现GA3在生根过程中阻碍了生长素对根原基细胞的诱导，阻碍根原基进一步生长发育形成根系[28-30]。ABA 是植物体内一种天然的抑制性植物激素，具有抑制细胞分裂的作用[31]。不同处理ABA含量总体变化趋势相似，前期愈伤组织形成期ABA 含量快速上升，L1和L2扦插42 d 即不定根生长阶段ABA 含量开始缓慢下降，L3处理ABA 含量呈现一定波动，但始终保持较高水平。插穗体内营养物质的水平对其不定根的产生有重要影响[32]，不同处理插穗可溶性糖含量缓慢上升，可溶性蛋白含量呈现一定波动，不断变化的C/N 值对根系生长发育不同阶段产生不同影响。在扦插生根过程中，离体的细胞、组织或器官其根系再生能力与年龄密切相关，母树年龄越低插穗生根能力一般愈强，1 年生的千年桐插穗其生根能力显著优于5 年生插穗。千年桐插穗保留一定数量的叶片和顶芽，能有效地促进其扦插生根，这与叶片及顶芽产生的内源激素和营养物质密切相关，内源物通过协同作用，共同促进插穗根原基细胞的生长发育，最后形成不定根。