ALV-J、REV和MDV多重荧光定量PCR检测方法的建立

2020-11-18刘丽娜罗青平

中国动物传染病学报 2020年6期

汪最，李丽，刘鹏，刘丽娜，汪琛，周康，罗青平

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064；2.农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉 430064；3.宣恩县畜牧兽医局，恩施445500）

禽肿瘤性疾病是目前造成畜禽养殖业经济损失的主要原因之一，是由能够诱发鸡只免疫抑制、产生肿瘤并大量死亡的传染性病毒引起[1]。这类病毒主要包括禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）、网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）和马立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）。ALV属于逆转录病毒属，致瘤部位主要在法氏囊和内脏[2]，目前我国存在最广泛、威胁最大的ALV亚群为J亚群ALV（ALV-J），ALV-J以髓系细胞为目标，可诱导迟发性髓细胞瘤[3]；REV属于丙型反转录病毒属，会引发禽类病理综合症并转化pre-B和pre-T淋巴细胞，导致法氏囊和T细胞淋巴瘤[4]；MDV属于甲型疱疹病毒属，线性双股DNA病毒，可转化T淋巴细胞，不仅导致皮肤和内脏肿瘤的形成，还可引起神经症状以及眼部病变[5]。由于以上病毒均属于免疫抑制病毒，会增加宿主并发或继发其他病原的感染概率[6]，同时，3种病毒之间也极易发生混合感染[7-8]，这都加大了临床诊断的难度，所以迫切需要一种能够同时检测ALV-J、REV和MDV的方法，以便快速、准确做出临床诊断。

现阶段的检测方法包括：ELISA、PCR、病毒分离鉴定等，相较于以上方法，荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。目前，已有检测3种肿瘤病病毒的单重荧光定量PCR方法，由于是单一检测，完成3种病毒检测工作耗时较长、成本高。因此，本研究基于ALV-J、REV和MDV各自的保守序列设计特异的引物和探针，首次建立了3种肿瘤病病毒多重荧光定量PCR检测方法，该方法操作简单、特异性强、敏感度高、稳定性好，可同时检测ALV-J、REV和MDV，为禽肿瘤性疾病的临床检测提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 毒株ALV-J野毒株分离自湖北宜昌某鸡场；MDV疫苗株购自中国兽医药品监察所；REV野毒株分离自湖北仙桃某鸡场；禽流感病毒、新城疫病毒（TS09-C株）、传染性支气管炎病毒（HB120）、腺病毒、坦布苏病毒野毒株均为本实验室保存。

1.2 主要试剂Axygen Viral RNA/DNA Extraction Kit购自康宁公司；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR、2×RapidTaqMaster Mix、pMD18-T和AceQ qPCR Probe Master Mix均购自诺唯赞公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 序列分析及引物设计与合成从GenBank中下载多个ALV-J的ENV基因、REV的LTR区和MDV的MEQ基因序列，使用DNAMAN进行多序列比对，分别筛选出ENV、LTR、MEQ片段的保守区域，再利用Primer Express 3.0软件进行引物和探针设计见表1。引物和探针均由生工生物工程（上海）有限公司合成，用ddH2O稀释为终浓度10 μmol/L。

表1 引物与探针序列Table1 Primer and probe sequences

1.4 重组质粒标准品的构建按照Axygen Viral RNA/DNA Extraction Kit说明提取ALV-J、REV和MDV的RNA/DNA，使用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR将RNA反转录为cDNA（MDV除外），使用表1中引物扩增目的基因，将回收的PCR产物与pMD18-T连接得到重组质粒，送生工生物工程（上海）有限公司测序，以鉴定正确的质粒为标准品，利用NanoDrop One/OnecSpectrophotometer测定标准品浓度，并对其拷贝数进行计算，公式如下所示：拷贝数=质粒浓度×6.02×1023/(660×质粒总长度)。

1.5 反应条件的优化及标准曲线的建立采用正交试验的方法，分别对引物浓度（10 μmol/L，0.1～0.8 μL）、探针浓度（10 μmol/L, 0.1～0.8 μL）以及退火温度（46℃～55℃）等进行优化，得到最佳反应体系和反应条件，再将阳性质粒标准品进行10倍连续稀释后，进行多重荧光定量PCR的扩增，得到标准曲线，计算其相关系数R2及其扩增效率E，并制作标准曲线的方程式。

1.6 特异性试验以REV、ALV-J、禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、坦布苏病毒的cDNA以及MDV、腺病毒和DF-1细胞基因组DNA为模板，利用建立的多重荧光定量PCR方法进行PCR扩增，同时设立阴性和空白对照，验证此方法的特异性。

1.7 敏感性试验将阳性质粒标准品进行10倍倍比稀释，10-1～10-10共稀释10个梯度记为1-10，取稀释好的质粒作为模板，使用建立的多重荧光定量PCR方法进行PCR扩增，验证此方法的敏感性。

1.8 稳定性试验将阳性质粒标准品进行10倍倍比稀释，选择稀释倍数为106、105和104的质粒作为模板，使用建立的多重荧光定量PCR方法进行PCR扩增，每个稀释度重复3次，根据荧光定量PCR反应的Ct值，计算组内变异系数；另取不同时间点分别进行3次荧光定量PCR扩增，根据每次荧光定量PCR反应的平均Ct值，计算组间变异系数。根据变异系数判断该方法的稳定性。

1.9 临床样品检测采用建立的多重荧光定量PCR方法对来自湖北宜昌、仙桃、荆门、孝感等地的51份肿瘤性病变组织和115份其他病变组织进行检测，同时应用OIE推荐的常规PCR法检测，比较2种检测方法的准确性。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的制备以表1所设计的引物分别对ALV-J、REV的cDNA以及MDV核酸DNA进行PCR扩增，扩增产物大小依次为166 bp、144 bp和114 bp。将目的基因克隆至pMD18-T载体，得到重组质粒标准品pMD-ALV、pMD-REV和pMD-MDV，其中pMD-ALV拷贝数为3.5×1010拷贝/μL，pMDREV拷贝数为5.1×1010拷贝/μL和pMD-MDV拷贝数为6.2×1010拷贝/μL。

2.2 多重荧光PCR反应条件的优化结果采用正交试验的方法，分别对引物浓度（10 μmol/L, 0.1～0.8 μL）、探针浓度（10 μmol/L, 0.1～0.8 μL）以及退火温度（46℃～55℃）等进行优化，得到最佳反应体系和反应条件。优化后引物浓度ALV-J为0.4 μL，REV和MDV为0.6 μL；探针浓度ALV-J为0.5 μL，REV为0.6 μL和MDV为0.4 μL；反应体系为25 μL，反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，51℃退火30 s，共40个循环；ALV-J（JOE）、REV（FAM）、MDV（TAMRA）荧光检测在51℃。阴性对照应无特异性扩增曲线或Ct值大于35.0，阳性对照Ct值小于等于35.0，且出现圆滑的特异性扩增曲线，则判定检测结果成立。在检测结果成立的前提下，检测样品Ct值小于等于35.0，且出现特异性的扩增曲线，判定为阳性；否则，判定为阴性。

2.3 标准曲线的构建以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，使用优化后的多重荧光定量PCR方法进行扩增，建立相应的标准曲线如图1所示。ALV-J、REV和MDV的相关系数R2均为1.00；扩增效率ALV-J为81.2%，REV为91.9%，MDV为96.4%，且在7个梯度稀释度范围内各点呈现良好的线性关系，符合荧光定量PCR检测标准。

2.4 特异性结果应用建立的多重荧光定量PCR方法对禽类常见病毒的核酸进行PCR扩增，结果见图2。该方法只对ALV-J、REV和MDV的核酸有特异性扩增，而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、腺病毒、坦布苏病毒以及DF-1细胞的核酸均无扩增荧光信号，表明该方法的特异性良好。

2.5 敏感性结果应用建立的多重荧光定量PCR方法对3种10倍连续稀释好的质粒标准品进行扩增，结果见图3。本研究建立的多重荧光定量PCR方法能够检测到3种肿瘤病病毒的最低检测限分别为35 copies/μL（ALV-J）、5.1 copies/μL（REV）和62 copies/μL（MDV），均表现出较高的灵敏度。

图1 多重荧光定量PCR的标准曲线Fig.1 Standard curve of ALV-J, REV and MDV

图2 多重荧光定量PCR特异性试验结果Fig.2 Specificity results of real-time PCR

2.6 稳定性试验结果应用建立的多重荧光定量PCR方法对不同浓度和批次的质粒标准品进行PCR扩增，结果见表2。组内变异系数为0.14%～0.91%，组间变异系数为0.36%～1.11%，变异系数均小于2.00%，表明所建立的检测体系稳定强，具有良好的重复性。

2.7 临床样品检测分别使用OIE推荐的常规PCR和本文建立的多重荧光定量PCR方法对来自湖北不同地区的51份肿瘤性病变组织和115份其他病变组织进行检测，结果见表3。多重荧光PCR共检出ALV-J单一感染36例，REV单一感染7份，MDV单一感染5例，ALV-J、REV双重感染2例，ALV-J、MDV双重感染1例以及ALV-J、REV、MD三重感染3例。而普通PCR除了对ALV-J单一感染检出率比多重荧光PCR稍低，其他检测结果保持一致。表明本文建立的多重荧光定量PCR方法适用于禽肿瘤病的临床样品的鉴别检测。

图3 多重荧光定量PCR的敏感性试验结果Fig.3 Sensitivity test of real-time PCR

表2 多重荧光定量PCR重复性试验Table 2 Intra-assay and inter-assay reproducibility test of real-time PCR assay

3 讨论

ALV-J、REV和MDV均能引起鸡群产生肿瘤疾病，仅凭病理变化很难做出诊断，而且各地区鸡群肿瘤病混合感染的病例数逐年上升，发病类型也更加复杂多变[9]。另外，ALV和REV最理想的防控手段是进行鸡场种群净化[10]。MDV虽有商品化疫苗，但MDV阳性率仍然居高不下，一方面由于MDV易发生自然重组，另一方面感染ALV-J的鸡群会影响MDV疫苗的保护效果[11]。因此，为了更好地对肿瘤病进行鉴别诊断和疫情防控，建立一种针对ALV-J、REV和MDV的快速、特异、敏感的分子生物学检测方法具有重要意义。

荧光定量PCR相较于传统PCR，不仅特异性更强，敏感度更高，同时还可对样本进行定量分析。多重荧光定量PCR是从荧光定量PCR基础上衍生而来，能够在一个反应管同时检测多个不同的目的基因，效率更高、成本更低[12]。本研究根据ALV-J的ENV基因、REV的LTR区和MDV的MEQ基因的保守序列，分别设计了对应的特异性引物和探针，通过对引物、探针浓度以及Tm值的优化，首次建立了同时检测3种肿瘤病的多重荧光定量PCR方法。本方法特异性好，仅可特异性检出ALV-J、MDV和REV，不会对其他禽类常见病毒产生非特异性扩增；灵敏度高，最低核酸检测线分别为35 copies/μL、5.1 copies/μL和62 copies/μL。应用所建立方法对来自湖北不同地区地的51份肿瘤病变组织和115份其他病变组织进行检测，结果显示，3种病毒在鸡群中均有发生，主要以单一感染为主，其中ALV-J的阳性率最高，达到了21.7%。双重和三重感染阳性率虽不高，但混合感染的问题依然存在。因此，加强对肿瘤病的鉴别诊断和疫情防控是很有必要的。此外，本方法不仅灵敏度高于OIE推荐的PCR方法，而且更加快捷简便，说明本方法适用于临床样品的检测诊断。