枯草芽孢杆菌WEI-62 体外益生评价及其对仔猪生长性能、肠道形态和肠道菌群的影响

2020-11-18黄玉岚霍小东姚宏明于海娜高长斌代发文

中国畜牧杂志 2020年11期

黄玉岚，霍小东，姚宏明，于海娜，高长斌，代发文,3*

（1.北京大伟嘉生物技术股份有限公司，北京 100085；2.北京市饲用微生态制剂工程技术研究中心，北京 100085；3.乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000）

随着动物饲料中促生长类抗生素添加剂的全面禁用，寻找安全绿色的替代品成为亟待解决的问题。可调控肠道菌群的益生菌成为一种有效的抗生素替代品。枯草芽孢杆菌具有耐酸、耐胆盐等特性，能够在胃肠道等各种环境中生存[1]，使其在养殖业中得到广泛应用。此外，枯草芽孢杆菌是被农业农村部（公告第2045 号）列为可直接在饲料中添加使用的添加剂。已有研究表明，饲粮中添加枯草芽孢杆菌可促进仔猪的生长发育[2-4]。目前，枯草芽孢杆菌对仔猪肠道菌群的研究还较少。本试验旨在研究日粮中添加枯草芽孢杆菌对仔猪生长性能、肠道形态和肠道菌群的影响，为枯草芽孢杆菌在仔猪生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株枯草芽孢杆菌WEI-62 为本实验室分离所得，并通过形态学、生化试验和序列比对鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌高浓度菌粉的主要成分为枯草芽孢杆菌，活菌数≥2×1011CFU/g。大肠杆菌CVCC1570 和产气荚膜梭菌CICC22949 分别购自中国医学微生物菌种保藏中心和中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 菌株的体外益生特性

1.2.1 耐酸和耐胆盐的测定枯草芽孢杆菌的耐酸性和耐胆盐的检测参考文献[5-7]方法进行测定：①耐人工胃液和人工肠液试验。枯草芽孢杆菌在LB 培养基中培养16 h 后，离心（8 000×g，4℃，10 min）收集菌体，用PBS 洗涤2 次后重悬于人工胃液[5-6]（将3 g/L 的胃蛋白酶加入到0.85%NaCl 溶液中，分别调节pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0）或人工肠液[7]（将1 g/L 的胰酶加入到含有0.3%、0.5%和1.0%胆盐的等渗缓冲液中，分别调节pH 至8.0）中，37℃培养3 h 后测定活菌数。②耐人工胃肠液试验。先将PBS 洗涤后的菌体重悬于pH 2.0的人工胃液中，37℃培养3 h 后，取样测定活菌数，其余悬液离心再重悬于0.3%胆盐的人工肠液中，37℃培养3 h 后测定活菌数。

1.2.2 体外抑菌活性的测定分别采用挖块法[8]和双层打孔法[9]检测枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抑菌活性。

1.3 试验设计试验采用单因素完全随机试验设计，选取健康、体重相近（7.26±1.35）kg的25日龄二元仔猪（长白×大白）216 头，随机分为2 组，每组6 个重复，每个重复18 头猪。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加1×106CFU/g 饲料重的枯草芽孢杆菌菌粉。试验期40 d。基础日粮参照NRC（2012）配制，基础日粮原料组成及营养成分见表1。

1.4 饲养管理猪舍使用前，清洗干净并消毒。试验期间仔猪每天加料2 次（10:00 和16:00），自由采食、自由饮水。保证猪舍内通风、温度、湿度等环境条件保持一致，其他饲养管理和免疫程序按猪场正常程序进行。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生长性能试验开始和结束时，以重复为单位称重，试验期间每天以重复为单位记录仔猪的采食量，计算平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.5.2 肠道组织形态试验结束后（即第41 天），每个重复随机选择1 头猪（体重与该重复平均体重接近）进行屠宰，结扎胃肠段后，于十二指肠和空肠的近端取2 cm左右肠段，浸于10%甲醛固定，用梯度乙醇逐级脱水，二甲苯洗涤，石蜡包埋，分别在十二指肠和空肠肠段的3～6 个位点，连续切取3～6 个肠环横断面，制备6 μm厚石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肠黏膜组织结构，并用图像采集系统采集相应组织图像。采用MIAS 软件测定十二指肠和空肠的绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度，每个样品至少测定10 根绒毛对应的绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度。

1.5.3 肠道菌群检测饲喂结束后（即第41 天），每个重复随机选择1 头体重与该重复平均体重接近的猪进行屠宰，分别取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠的内容物并收集刮取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠的黏膜物质，每组采集的内容物和黏膜样品分别装入离心管并置于-20℃冰箱冷冻保存，用于提取全基因组，采用高通量测序分析（委托北京新科开源基因科技有限公司完成）各肠道部分的菌群组成。

1.6 统计分析试验数据经Excel 2010 整理后，用SPSS 19.0 软件的一般线性模型进行统计分析，Duncan´s 法进行多重比较。试验结果均以平均值±标准差表示，其中0.05＜P＜0.1 表示有变化趋势，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

表1 基础日粮配方及营养成分（风干基础）

2 结果

2.1 菌株体外益生特性

2.1.1 耐酸和耐胆盐的能力由图1 可知，枯草芽孢杆菌WEI-62 在人工胃液pH 2.0、pH 2.5 和pH 3.0 时的存活率分别为77.63%、86.49%和90.70%，在pH 3.0时存活率显著高于pH 2.0 和pH 2.5 处理组。由图2 可知，在不同浓度胆盐条件下，各处理菌株的存活率无显著差异，均在90%以上。由图3 可知，在人工胃肠液处理下，胃液处理3 h，菌株存活率为77.04%，再用肠液处理3 h 后，存活率为76.54%，肠液处理前后差异不显著。无论是在低pH 条件下还是在不同浓度胆盐条件下，枯草芽孢杆菌WEI-62 都有较高的存活率。

2.1.2 体外抑菌活性由表2 可见，枯草芽孢杆菌菌株具有抑制大肠杆菌CVCC1570 和产气荚膜梭菌CICC22949的活性。

2.2 枯草芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响由表3 可知，与对照组相比，在日粮中添加枯草芽孢杆菌可降低仔猪的耗料增重比（P＜0.05）。添加枯草芽孢杆菌对仔猪的平均日增重、平均日采食量及死淘率均无显著影响。

表2 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌CVCC1570 和产气荚膜梭菌CICC22949 的抑菌活性

表3 枯草芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响

2.3 日粮中添加枯草芽孢杆菌对仔猪肠道形态结构的影响由表4 可知，日粮中添加枯草芽孢杆菌对仔猪十二指肠的绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度以及空肠的绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度均无显著影响。

表4 饲喂枯草芽孢杆菌WEI-62 对仔猪的十二指肠和空肠组织形态的影响 μm

2.4 日粮中添加枯草芽孢杆菌对仔猪肠道菌群的影响如图4 所示，各肠段黏膜和内容物样品的优势菌群有厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、软壁菌门（Tenericutes）、蓝细菌门（Cyanobactiria）和放线菌门（Actinobacteria）。试验组的结肠黏膜和内容物中厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度高于对照组，但空肠黏膜、盲肠黏膜和十二指肠内容物的厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度低于对照组。试验组十二指肠黏膜和回肠黏膜的变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度低于对照组，但十二指肠内容物、空肠内容物和回肠内容物的变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度高于对照组。试验组空肠黏膜、结肠内容物的拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度低于对照组，但十二指肠黏膜、盲肠黏膜和盲肠内容物的拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度高于对照组。试验组和对照组的空肠黏膜和回肠黏膜的软壁菌门（Tenericutes）的相对丰度高于其他肠段样品，而且试验组的相对丰度高于对照组；十二指肠内容物和空肠内容物的蓝细菌门（Cyanobactiria）的相对丰度高于其他肠段。因此，从门水平的结果表明，饲喂菌株WEI-62没有明显改善仔猪肠道菌群结构。

如图5 所示，除了空肠黏膜和回肠黏膜外，其余肠段样品中，试验组的乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度均高于对照组，尤其是回肠内容物的乳酸杆菌属（Lactobacillus）几乎是绝对的优势菌属。由于本批样品中未检测到志贺-埃希氏菌属（Escherichia-Shigella），所以将梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）作为致病菌的代表菌属进行分析，试验组回肠、盲肠和结肠的内容物的梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）的相对丰度低于对照组，其余肠段样品中，试验组和对照组的梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）的相对丰度相差不大。因此，从属水平的结果表明，饲喂菌株WEI-62 可以改善仔猪肠道菌群结构。

由图4 和图5 可知，虽然饲喂菌株WEI-62 后，仔猪肠道菌群中的厚壁菌门的相对丰度没有得到明显改善，但乳酸杆菌属的相对丰度明显高于对照组，梭菌属的相对丰度低于对照组。因此，菌株WEI-62 针对肠道菌群的调节是有效的。

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌的生物学特性枯草芽孢杆菌已被广泛认为可以促进人和动物的健康。在体内研究中，摄入的微生物需通过低pH 的酸性胃环境，还需要暴露在小肠高浓度的胆盐中[10]。因而，益生菌对胃肠道的耐受性是体外评价益生菌的关键指标之一。本研究结果显示，枯草芽孢杆菌对低pH 的酸性环境和高浓度的胆盐具有较高的耐受性。这可能与枯草芽孢杆菌在抵御极端环境时会形成孢子有关。La Ragione 等[11]研究表明，枯草芽孢杆菌可以在胃肠道中完成从孢子萌发形成营养体到再生孢的整个生命周期；事实上，正是由于其对胃肠道的耐受性，才使得在口服的情况下仍能抑制胃肠道中的大肠杆菌等致病菌。此外，抑菌活性也是体外菌株有效性评价的一个重要指标。不同的枯草芽孢杆菌对于病原菌的抑菌活性不同。大多数枯草芽孢杆菌都具有高效的抑菌活性，这表明其在肠道中具有抑制病原菌的潜力。家禽体内的研究表明枯草芽孢杆菌 NIU068 和枯草芽孢杆菌 PY79（hr）具有抑制大肠杆菌和产气荚膜梭菌的作用[12-13]。本研究检测出枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌CICC22949 和大肠杆菌CVCC1570 都具有抑菌活性，表明其可能在体内具有抑制该病原菌的潜力。目前体外的筛选结果和动物体内的试验结果之间的相关性仍不清楚。

3.2 枯草芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响本研究发现，在日粮中添加1×106CFU/g 枯草芽孢杆菌菌粉WEI-62后显著降低了仔猪的耗料增重比，提高了仔猪的日增重和日采食量，但无显著差异。黄雪泉[14]研究发现，与金霉素对照组相比，1×106、2×106、2×107CFU/g 枯草芽孢杆菌组均未显著提高仔猪的平均日增重和降低耗料增重比。枯草芽孢杆菌进入仔猪体内时可以耐受动物机体的酸性环境、胆盐和消化液等，从而到达肠道。枯草芽孢杆菌在猪的胃肠道近端迅速萌发[15]，消耗肠道中的氧气，与致病菌竞争氧气及其他营养成分，促进肠道菌群平衡；而且还能产生和分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶来促进营养物质的消化吸收[16]。这可能是本研究中添加枯草芽孢杆菌可以显著降低耗料增重比的原因之一。

3.3 枯草芽孢杆菌对仔猪肠道形态的影响肠道健康对断奶仔猪的整体代谢、生理、疾病防御和生长发育至关重要。肠道健康包括对营养物质的消化和吸收能力、排泄代谢废物、肠道屏障、稳定的微生物群落、肠道免疫系统以及没有肠道疾病[17]。肠道绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度反映小肠的消化吸收能力。肠道绒毛高度增加使肠内总表面积增大，促进营养物质的消化和吸收[18]；隐窝深度反映肠上皮细胞的更新速度，隐窝变浅说明上皮细胞生成率高，更新快[19]；而黏膜的厚薄与营养物质的吸收和转运过程有关，进而影响小肠的吸收功能。绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比越高，说明小肠消化吸收好。本研究中，枯草芽孢杆菌组仔猪的绒毛高度和黏膜厚度都高于对照组，隐窝深度低于对照组，说明枯草芽孢杆菌可促进仔猪的消化与吸收，但组间无显著差异。邓军等[20]研究发现，添加枯草芽孢杆菌可以显著增加仔猪的十二指肠绒毛长度，对空肠无显著影响；显著降低空肠的隐窝深度，对十二指肠无影响。李海花等[21]试验发现，饲粮添加枯草芽孢杆菌可显著提高仔猪的空肠绒毛高度，对十二指肠无显著影响，对十二指肠和隐窝深度均无显著降低作用。造成结果差异的原因可能与动物个体差异和菌株差异性有关。

3.4 枯草芽孢杆菌对仔猪肠道菌群的影响肠道菌群平衡与动物生长、发育和健康有着密切的联系。肠道菌群具有多种生理功能，包括免疫调节、营养与代谢和保护功能[22]。研究报道饲喂益生菌可影响肠道菌群的多样性、组成和相对丰度。Tang 等[23]研究发现，在日粮中添加枯草芽孢杆菌可以提高断奶仔猪结肠中芽孢杆菌和双歧杆菌的数量。Poulsen 等[24]研究表明，芽孢杆菌可提高仔猪肠道菌群组成的多样性和结肠菌群的丰度。本研究中，饲料中添加枯草芽孢杆菌能够提高乳酸杆菌属的相对丰度和降低梭菌属的相对丰度，表明添加枯草芽孢杆菌可调节仔猪的肠道菌群。枯草芽孢杆菌进入猪肠道后萌发可通过竞争黏附位点和营养素来竞争排斥致病菌，可通过免疫调节和保护肠道屏障来促进肠道健康[15,25]。