版纳微型猪近交系PSP-I基因的克隆及生物信息学分析

查星琴 ，成文敏，潘伟荣，李海昌，张 莹，霍金龙，黄 英

（1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；3.云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201）

版纳微型猪近交系（Banna Minipig Inbred Line，BMI）在发育、生理、解剖、病理、疾病发生等诸多方面与人类极其相似，是研究转基因动物、异种器官移植、生物医学及猪基因组计划中功能基因的理想实验动物模型[1-4]。本实验室通过长期的统计、观察和基础研究发现，BMI 在培育过程中，繁殖力较低的亚系精液品质相对较差、畸形率较高。但常规的精液品质指标对于评估公猪的繁殖力具有一定局限性，从分子方面对精液品质进行选择标记，研究与精液品质相关的基因，有利于快速和准确地筛选精液，为公畜繁殖育种提供科学依据。

精浆蛋白是由哺乳类雄性动物性腺、副性腺分泌的对精子细胞形成发育具有重要调节功能的一类多功能蛋白。精子黏附蛋白家族（AQNl、AQN3、AWN、PSP-I和PSP-II）含量占精浆总蛋白的90% 以上，是公猪精浆蛋白的主要成分[5]，在精子获能、顶体反应、运动（超活化）及精卵融合中具有重要调控作用[5-9]。猪精浆蛋白-I（Porcine Seminal Protein-I，PSP-I）和猪精浆蛋白-II（Porcine Seminal Protein-II，PSP-II）是2 个主要的精子黏附蛋白成员，其含量占精浆总蛋白的50%以上，主要在精囊腺表达，在其他副性腺组织中仅有少量表达[10]。二者分子量为14～16 ku，序列同源性为45.2%，氨基酸序列中均含有1 个CUB 结构域，分别由109 和116 个氨基酸残基组成成熟肽。PSP-I 和PSP -II 主要以非共价异源二聚体形式存在于精浆中，主要参与生殖免疫调控、精子能动性维持、精子膜完整性、精子线粒体活性、受精等一系列重要的生殖过程[11-12]。目前，对PSP-I 蛋白的研究鲜有报道，在BMI 上更是未见报道。本研究采用RT-PCR 方法克隆BMI 的PSP-I基因并对其进行生物信息学分析，为深入研究BMIPSP-I基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 采集活体去势成年（15 月龄）BMI 不育公猪睾丸组织，经液氮处理后，置于-80℃超低温冰箱保存以备RNA 提取。本实验所用试剂DNA片段回收纯化试剂盒购自全式金生物技术有限公司，逆转录酶XL（AMV）、DL2000、RT-PCR 一步法试剂盒、Competent Cell Preparation Kit、病毒总RNA/DNA 提取试剂盒（TaKaRaMiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、TaKaRa Ex TaqTMTaq 酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司，pMD18-T 克隆载体和大肠杆菌感受态细胞DH5α购于TaKaRa 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 合成引物 下载GenBank 上猪的PSP-I基因的保守序列（基因登录号：NM_213837），运用Primer Premier5.0 和Oligo 6 软件设计1 对特异性引物（F：5´-TCTCCAGGTGGACCCGAAATAT-3´，R：5´-TAGCAG GGAAGACAGGAAAGGC-3´），交上海生工有限公司合成，预计扩增目的片段的大小约为420 bp。

1.2.2 RNA 的提取及cDNA 合成 称取BMI 睾丸组织样品约100 mg，依照RNA Plus（TaKaRa）公司相应步骤提取总RNA，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，以检测合格的总RNA 为模板，参考反转录试剂盒说明书的步骤进行反转录，转录体系：在20 μL 反应体积中，加入2 μg（10 μL）的Total RNA 样品、1 μL 的Oligo（dT）18（50 μmol/L）和1 μL 的dNTP（10 mmol/L）混合物后，轻轻混匀置于70℃孵育5 min 后，快速放在冰上冷却；短暂离心后再加入4 μL 的5×first Buffer、2 μL 的DTT（0.1 mol/L）及1 μL 的recombiant RNase inhibitor，轻微吹打混匀，37℃孵育2 min，室温下加入1 μL的reverse transcriptase M-MLV（200 U/ μL），稍微吹打将各组分混匀，37℃孵育10 min，最后53℃将其加热1 h，94℃反应5 min，终止反应，储存于-20℃备用。

1.2.3PSP-I基因PCR 扩增反应体系与程序 PCR 反应总体系25 μL：1 μL DNA 模板（25 ng/ μL）、12.5 μL Premix Taq（5 U/μL）、上下游引物（10 pmol/μ L）各1 μL，加ddH2O 补足至 25 μL。PCR 扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30 个循环；72℃延伸8 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统拍照。

1.2.4 PSP-I 基因克隆 采用DNA 纯化回收试剂盒回收纯化PCR 产物，取一份纯化产物送上海生工有限公司直接进行测序，另取一份纯化后的目的片段连接到pMD18-T 克隆载体上在 l6℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并提取质粒，经PCR 再扩增和酶切鉴定后，筛选出阳性菌液送到上海生工生物技术有限公司序列测定。

1.2.5PSP-I基因序列的生物信息学分析 将测序得到的PSP-I基因编码区序列采用Generunr 软件进行比对，人工校对预测出开放阅读框；利用ExPaSyProtParam程序推测PSP-I基因编码蛋白分子量、等电点、序列氨基酸的组成、总亲水性和稳定性；采用NCBI 数据库中的nucleotide blast 软件检验核苷酸的序列；NetNGlyc 1.0 Server 预测蛋白质N-糖基化位点；NetOGlyc 4.0 Server 预测蛋白质O-糖基化位点；SignalP 4.1 Server预测信号肽序列；NetPhos 2.0 Server 预测蛋白质磷酸化位点；TMpred server 预测跨膜结构域；ExPASy-PrtPram tool 参与编码蛋白质的结构分析；SOPMA 参与蛋白质的二级结构预测。

2 结果与分析

2.1PSP-I基因扩增结果 将PSP-I基因进行扩增，特异性片段为420 bp，经电泳检测，目的基因片段大小与预期片段大小一致（图1）。

2.2PSP-I基因序列分析 登录http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/，将所得测序结果与GenBank 中下载的猪PSP-I基因序列进行比对，如图2 所示，有2 处突变位点，分别在第80 bp 和352 bp 处，其中第80 位碱基G 突变为A，第352 位碱基A 突变为G，将测序结果推导的氨基酸序列与GenBank 中下载的猪PSP-I 蛋白进行比对（图3），第27 位氨基酸由I（异亮氨酸）突变为V（缬氨酸）。

2.3PSP-I基因序列生物信息学分析 用ExPaSyProtParam程序预测PSP-I基因编码蛋白分子量为8.588 9 ku，理论等电点为8.64；在氨基酸组成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有8 个；碱性氨基酸（Lys+Arg）有10 个；其中亮氨酸（Leu，占12.7%）、丝氨酸（Ser，占11.4%）、甘氨酸（Gly，占11.4%）等含量较高。

PSP-I 蛋白质不稳定指数为34.99，属于稳定蛋白；脂溶指数为90.00，总的亲水性平均系数（Grand Average Of Hydropathicity，GRAVY）为-0.241，具有疏水性。使用SignalP 4.1 对PSP-I 蛋白进行预测，表明PSP-I 蛋白没有信号肽位点（图4）；用NetNGly 1.0进行预测的结果表明，在第17 位有一个N-糖基化位点是NLTC（图5）。

NetPhos2.0 预测表明，PSP-I 蛋白存在8 个磷酸化位点，其中5 个丝氨酸（Ser）磷酸化位点（A51、A52、A62、A67、A77）、0 个苏氨酸（Thr）磷酸化位点、3 个酪氨酸（Tyr）活性位点（A7、A24、A69）（图6）。

用SOPMA 方法预测的PSP-I 蛋白的二级结构如图7 所示，参与α-螺旋的氨基酸有9 个，含量为11.39%；有30 个氨基酸参与延伸链，占37.97%；15个氨基酸可能参与β-转角，占18.99%；25 个氨基酸可能参与无规则卷曲，占31.65%。以上分析可以推测，无规则卷曲是PSP-I 蛋白的主要结构。

3 讨 论

精子黏附蛋白基因家族是由猪、马、牛、羊等有蹄类动物生殖道分泌的一类新颖的蛋白家族，能结合磷脂、寡糖、丝氨酸蛋白酶和硫酸多糖的配基发挥多种功能。其既是精浆蛋白中起重要作用的蛋白，也是占最大比重的蛋白[10]，分子量一般为12.16 ku，呈松散附着在精子细胞表面。该蛋白家族在公猪成熟精子中的mRNA表达丰度很高[13]，在受精过程的各个阶段参与精子获能和顶体反应、调节精子活力、在雌性生殖道形成精子库等多种生物功能[5,14]。公猪精浆中的AQNl、AWN、AQN3、PSP-I、PSP-II 5 个精子黏附蛋白家族成员已被分离鉴定。PSP-I 和PSP Ⅱ是公猪精液中含量最高的蛋白，为公猪生殖道组织特异性蛋白，揭示该基因的表达具有组织特异性。射精后PSP-I 和PSP-II 在精液中形成异二聚体复合物，在公畜生殖道内可维持精子稳定性，在母畜生殖道内可促进精子获能；在精子冷冻中可修补解冻后损伤的精子膜，提高精子活力。Centurion 等[15]报道PSP-I/PSP-II（纯化）二聚体可对高倍稀释的精子起到保护作用，在生理温度下可在5 h 内保持精子的运动能力、活力和线粒体活性。以上研究表明猪PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白在受精过程中发挥重要作用，但目前对PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白的研究较少，对于PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白在繁殖育种中所能发挥的作用缺乏全面的评价。因此，克隆分析PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白具有重要意义。

本研究克隆得到BMI 的PSP-I基因序列长度为420 bp，其核苷酸序列中包含241 bp 的编码区和179 bp的非编码区，经基因序列比对后，编码区有1 个碱基发生突变，其中第80 位碱基G 突变为A，将测序结果推导的氨基酸序列与GenBank 中下载的猪PSP-I 蛋白进行比对，第27 位氨基酸由I（异亮氨酸）突变为V（缬氨酸）。但这个碱基的突变是否引起PSP-I 蛋白结构和功能发生改变，从而造成版纳微型猪近交系弱精的产生还有待深入研究。

PSP-I 蛋白质属于稳定蛋白，具有疏水性。PSP-I蛋白没有跨膜信号肽位点，在第17 位有1 个N-糖基化位点是NLTC。本实验中PSP-I 蛋白存在8 个磷酸化位点，其中5 个丝氨酸（Ser）磷酸化位点（A51、A52、A62、A67、A77）、0 个苏氨酸（Thr）磷酸化位点、3 个酪氨酸（Tyr）活性位点（A7、A24、A69）。在BMI PSP-I 蛋白序列中只存在3 个潜在的酪氨酸磷酸化位点，推测可能由于酪氨酸磷酸化位点较少，导致对蛋白的修饰和调控较低，PSP-I 蛋白的活性较弱，才引起BMI 繁殖力低下，具体原因仍需进一步的深入研究。