黔北麻羊StAR 基因的克隆、生物信息学分析及在单、多羔黔北麻羊不同性腺组织中的表达

杨沛方，周志楠，敖 叶，陈 祥*

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025）

黔北麻羊俗称“麻羊”，属短毛型皮肉兼用山羊，是贵州省优良地方山羊品种[1]，于1993 年收录至《贵州省畜禽品种志》，2011 年被《中国畜禽遗传资源志-羊志》收录，2013 年获得国家农产品地理标志登记保护[2]。该品种羊主要分布于贵州省遵义市习水、仁怀的山区，具有耐粗饲、适应性强、生产性能优等特点，且皮张品质优良，羊肉鲜美，深受广大养殖户及消费者的喜爱[3]。

多胎性状作为衡量雌性动物是否优良的一项重要繁殖指标，受排卵率、卵泡数量和质量以及生长发育情况的影响。研究发现类固醇激素、相关调控生长因子等参与卵泡生长发育调控[4]。而类固醇激素的合成对雌性动物卵泡的生长发育、闭锁卵泡以及卵泡的增殖、凋亡都有调控作用。类固醇激素合成急性调节蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）也称类固醇激素灵敏调节蛋白，是胆固醇由线粒体外膜到内膜的一种转运蛋白，在胆固醇的代谢以及类固醇激素的合成中起关键作用[5]。胆固醇在线粒体内细胞色素氧化酶的作用下转化为氧化固醇，在卵巢内由卵泡膜细胞和颗粒细胞合成生殖激素[6]。研究表明，StAR不仅存在于类固醇激素生成组织（肾上腺、睾丸、卵巢），还广泛表达于其他组织，在卵巢中表达量较高[7]。可见，StAR在卵巢发育及排卵过程中的作用不可或缺。此外，StAR在调节睾酮的合成过程中起重要作用，是维持正常生理功能所必须的一种重要蛋白[8]。目前StAR基因mRNA 已在猪[9]、绵羊[10]、小鼠[11-12]、鹅[13]等多种动物的卵巢、睾丸中建立组织表达图谱，猪StAR基因也已被克隆并测序验证[14]，但其在黔北麻羊上的研究却鲜见报道，其对山羊产羔性状的直接关联性也有待进一步研究。故本研究通过qRT-PCR 技术检测StAR基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达量，克隆出黔北麻羊StAR基因编码序列进行生物信息学分析，为进一步探讨StAR基因生物学功能以及对山羊产羔的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物选自贵州省习水县黔北麻羊中心产区富兴牧业有限公司，选取体况良好、健康无病、饲养管理、营养水平及免疫程序相同的18～24 月龄单、多羔母羊，屠宰后半小时内用经高压灭菌后的镊子、剪刀等工具采取其下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫等组织，锡箔纸包装标签后放入液氮低温保存送至实验室，置于-80℃冰柜中备用。

1.2 主要试剂及仪器 TRIzol、qPCR Mix、胶回收试剂盒、逆转录试剂盒、液氮（-196℃）、氯仿、50×TAE缓冲液、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、氨苄青霉素购自贵州鼎国生物有限公司；pMD-19T、DNA Marker 2000购自大连宝生物工程有限公司；T4 连接酶、LB 培养基粉末购自上海生物工程技术服务有限公司。紫外可见分光光度计（型号：NANODROP 2000）、37℃摇床购自美国Thermo Fisher 公司；电泳仪（DYY-2C 型）、瞬时离心机、振荡器购自北京六一仪器厂；PCR 扩增仪（C1000 TouchTM）、CFX 96 罗氏实时荧光定量PCR 仪、凝胶成像系统（Universal Hood II）购自BIO-RAD 有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物的设计、合成 根据Genbank 数据库收录的山羊StAR基因（登录号为：XM_013975437.2）序列，利用Primer-BLAST 在线软件设计其克隆和荧光引物各1 对。在StAR基因上下游处分别添加XhoI 与KpnI酶切位点并设置相应的保护碱基，选取β-actin为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。引物合成后为粉末状易粘附管壁，以4 000 r/min离心1 min后按照相应稀释比例（10 μmol/μL）加入灭菌后的ddH2O，稀释后分装保存于-20℃备用。

1.3.2 组织总RNA 提取及首链cDNA 的合成 按照Trizol 法提取组织总RNA，分光光度计测定其浓度及OD 值（OD260/OD280），鉴定满足后续实验的组织总RNA 通过HiFi Saript 逆转录试剂盒合成首链cDNA，逆转录体系20 μL：dNTP mix 4 μL、HiFi-Saript 1 μL、DTT 0.1 mol/L 2 μL、Primer mix 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、RNA 模板 1 μL、RNase-Free water 补充至20 μL。反应条件：42℃，30 min；85℃，5 min，最后将反应产物置于-20℃冰箱保存，以备后续实验。

1.3.3 实时荧光定量PCR 检测StAR基因在不同组织中的表达水平 在荧光定量PCR 仪上采用SYBR Green I荧光染料的方法对单、多羔母羊不同组织进行StAR基因mRNA 表达水平的检测。将逆转录所得到的单、多羔母羊不同组织（下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫）的cDNA 稀释至等浓度（500 ng/μL）作为模板。反应体系10 μL：qRT-PCR mix 5 μL、cDNA 模板1 μL、上下游引物（100 μM）各0.5 μL、ddH2O 3 μL。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s 并添加机器自带的熔解曲线。每组3 个重复样按照预先设定程序进行qRT-PCR 反应。

表1 引物信息

1.3.4 PCR 扩增黔北麻羊StAR基因CDS 区 以卵巢组织首链cDNA 为模板，扩增StAR基因的CDS 区，PCR 扩增体系为10 μL：2×Es Taq Master Mix 5 μL、上下游引物（100 μM）各0.75 μL、cDNA 1.5 μL、ddH2O 补充至10 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性10 s，退火（58℃）50 s，72℃延伸1 min，72℃终延伸10 min，PCR 反应结束后，产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的条带。

1.3.5StAR基因的克隆、转化与验证 经凝胶电泳检测扩增产物为所需目的条带，按照胶回收试剂盒对其进行胶回收，做好标记，利用分光光度计对浓度和纯度检测。将胶回收产物与pMD-19T 在金属浴16℃连接12 h，再将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂板，37℃恒温培养箱过夜培养。挑取白斑菌种至含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、200 r/min 摇晃培养12 h。选取浑浊菌液进行菌液PCR 反应，凝胶电泳检测，筛选出正确目的条带的阳性菌液送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。

1.3.6 黔北麻羊StAR基因生物信息学分析 菌液测序后，应用DNA Star 软件比对StAR基因序列并使用MegAlign 将碱基序列翻译为氨基酸序列，选取绵羊、小鼠、大鼠、猪、鸡、人、白尾鹿、一角鲸、苏门答腊猩猩等9 个物种的StAR基因序列与黔北麻羊进行同源性比对并构建相应物种的系统发育进化树。使用Prot Param（http://expasy.org/tools/protparam.html）分析StAR 蛋白理化性质；分别利用SOPMA（http://nps apbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automa t.pl?page=npsa_sopma.html）软件与SWISS-mode 软件分析、预测StAR 蛋白质二、三级结构；运用ProtScale 程序分析StAR 蛋白的疏水性；利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测StAR氨基酸的磷酸化位点；最后利用PSORT II Prediction 在线网站（http://psort.hgc.jp/form2.html）对StAR 蛋白进行亚细胞定位分析。

1.4 统计与分析 运用Excel 2007 对荧光定量数据Cq值进行统计整理，利用相对定量法2-△△CT处理实时荧光定量PCR 数据，数据以平均数±标准差表示，采用SPSS 17.0 统计分析软件进行处理。组内单、多羔母羊不同组织表达量的比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间单、多羔母羊不同组织表达量的比较采用配对样本t检验。LSD 法进行差异显著性的检验，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 黔北麻羊StAR基因的PCR 扩增 如图1 所示，荧光引物扩增出约为161 bp 大小的片段，CDS 区引物扩增出约为858 bp 大小的片段，均与预测目的片段大小一致，且条带较为清晰、单一，可用于后续实验。

2.2 qRT-PCR 检测StAR基因mRNA 在不同组织的表达水平 由图2 可知，StAR基因在单羔母羊的下丘脑-垂体-性腺轴（卵巢、输卵管、子宫）的表达呈现波状形式，StAR基因在单、多羔黔北麻羊卵巢组织中表达量最高，极显著高于其他组织，在子宫组织中的表达量最低。StAR基因在单羔黔北麻羊中的表达量依次为：卵巢＞输卵管＞垂体＞下丘脑＞子宫，其中垂体的表达量显著高于下丘脑，其余均呈现极显著差异。StAR基因在多羔黔北麻羊中的表达量依次为：卵巢＞垂体＞下丘脑＞输卵管＞子宫，在垂体中的表达量显著高于下丘脑，但在子宫与输卵管之间未达到显著性差异。经组间比较可知，StAR基因在单羔黔北麻羊输卵管中的表达量极显著高于多羔黔北麻羊，相反在多羔黔北麻羊卵巢中的表达量却极显著高于单羔黔北麻羊。

2.3 黔北麻羊StAR基因T 克隆载体的鉴定 如图3 所示，目的条带明亮清晰、单一且位于858 bp 处。阳性菌液经测序后显示，黔北麻羊StAR基因相比于NCBI中山羊StAR基因的CDS 区序列吻合度高达99.53%，共发生4 处突变，分别是第139、312 位碱基由C 突变为T，第160 位碱基由T 突变为G，第315 位碱基由T突变为C。4 处突变中有2 处为同义突变，2 处为错义突变，同义突变没有引起氨基酸序列的改变，错义突变分别由第139 位与第160 位碱基的改变所引起，其中第139 位碱基的突变导致氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸，第160 位碱基的突变导致氨基酸由原始的亮氨酸突变为精氨酸。菌液PCR 及测序验证证实StAR基因编码序列已成功克隆至pMD-19T 载体中，pMD-19T-StAR 亚克隆载体构建成功。

2.4 黔北麻羊StAR基因的生物信息学分析

2.4.1 黔北麻羊StAR 蛋白理化性质分析 黔北麻羊StAR基因编码区包含858 个碱基，共编码285 个氨基酸，蛋白分子量约为31.87 ku，理论等电点为9.12，ExPASy 显示黔北麻羊StAR 是由1 398 个C 原子、2 295 个H 原子、409 个N 原子、410 个O 原子以及15 个S 原子组成的化学式为C1398H2295N409O410S15的分子，共由4 527个原子构成，在哺乳动物体中的半衰期约为30 h。就其氨基酸组成而言，StAR基因编码序列主要由亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸组成，分别占氨基酸总数的11.9%、8.1%、8.1%、8.1%；组氨酸与苯丙氨酸的含量最少，仅有1.4%；带正电荷的氨基酸残基数量大于带负电荷的残基，证明黔北麻羊StAR 编码的氨基酸序列带正电。另外，StAR 蛋白的不稳定指数为42.66（不稳定指数＞40），可将此蛋白视为不稳定蛋白。

2.4.2 黔北麻羊StAR 蛋白疏水性预测与分析 ProtScale分析黔北麻羊StAR 蛋白疏水性图谱见图4，横坐标为StAR 编码的氨基酸序列位置，纵坐标代表疏水性评分，以0 分为界，数值越大，疏水性越强，数值越小，亲水性越强。黔北麻羊StAR 编码的285 个氨基酸序列中，第95 位甘氨酸亲水性最强，评分为-3.000，第201 位谷氨酸疏水性最强，评分为1.789。0 分以下氨基酸数量大于0 分以上，证明黔北麻羊StAR 蛋白为疏水性蛋白，ExPASy 程序分析得出StAR 蛋白亲水平均值为-0.276，ProtScale 程序与ExPASy 程序对其得出的结论一致。

2.4.3 黔北麻羊StAR 蛋白质高级结构分析与预测 将克隆出的StAR 编码的285 个氨基酸序列放入SOPMA在线分析软件发现，黔北麻羊StAR 蛋白质二级结构主要由106 个α-螺旋、17 个β-转角、111 个无规则卷曲与51 个延伸链组成（图5），分别占比为37.19%、5.96%、38.95%、17.89%，可见黔北麻羊StAR 蛋白质二级结构主要由α-螺旋与无规则卷曲构成。进一步使用SWISS 程序预测黔北麻羊StAR 蛋白质三级结构（图6），发现α-螺旋与无规则卷曲占据整个结构大部分，与二级结构分析结果一致。

2.4.4 黔北麻羊StAR 蛋白亚细胞定位分析 运用PSORT II Server 在线网站对黔北麻羊StAR 蛋白进行亚细胞定位分析，发现其有可能位于真核生物的线粒体、细胞质、细胞核、内质网、细胞骨架等5 种结构中，预测比例分别为47.8%、30.4%、13.0%、4.3%、4.3%，在线粒体中的可能性最大，在内质网以及细胞骨架中的可能性最小。

2.4.5 黔北麻羊StAR 磷酸化位点的预测 通过NetPhos 3.1 Server 程序分析磷酸化位点得知，黔北麻羊StAR 可能存在23 个磷酸化位点，其中包括14 个丝氨酸磷酸化位点（分别位于第12 位、第13 位、第19 位、第57 位、第61 位、第66 位、第69 位、第100 位、第150 位、第186 位、第195 位、第233 位、第261 位、第277位氨基酸）、5 个苏氨酸磷酸化位点（分别是第5 位、第190 位、第204 位、第240 位、第263 位氨基酸）、4 个酪氨酸磷酸化位点（分别是第68 位、第75 位、第134 位、第206 位氨基酸）。

2.4.6 黔北麻羊StAR 氨基酸同源性分析以及系统进化树的构建 选取绵羊、小鼠、大鼠、猪、鸡、人、白尾鹿、一角鲸、苏门答腊猩猩等9 个物种与黔北麻羊StAR基因编码序列进行同源性分析，结果显示黔北麻羊StAR编码序列与绵羊、小鼠、大鼠、猪、鸡、人、白尾鹿、一角鲸、苏门答腊猩猩的同源性分别为98.6%、83.8%、84.5%、90.2%、68.0%、87.0%、95.1%、91.6%、87.0%（图7），可见，黔北麻羊StAR 编码序列在哺乳动物中具有较高的相似性，与非哺乳动物（鸡）的相似性较低。同时，采用NJ 法构建的系统进化树得出哺乳动物聚集成为一个大分支，黔北麻羊与绵羊的亲缘关系最近，与鸡的亲缘关系最远。黔北麻羊StAR基因编码序列具有良好的种属特异性，与对比的10 个物种亲缘关系依次为绵羊＞白尾鹿＞一角鲸＞猪＞小鼠＞大鼠＞人＞苏门答腊猩猩＞鸡（图8），与同源性分析结果一致。

3 讨 论

类固醇激素（Steroid Hormone）的合成与分泌受机体内分泌系统、神经系统调节，在母畜繁殖过程中发挥着重要作用。StAR 是类固醇激素合成过程中具有高度特异性的调节因子，位于相关细胞的线粒体膜上，对胆固醇进入线粒体内膜合成类固醇激素的过程具有限速作用[15]。已有大量研究证实，StAR 能够参与卵泡的生长发育，调控排卵以及成熟卵泡的运输等多种生理过程，并能在卵巢组织中特异性表达[16-17]。苗艳平等[18]在对绵羊卵巢oar-mir-150 靶向调节类固醇激素合成急性调节蛋白基因的表达研究中发现StAR基因卵泡期较黄体期表达显著上调。但StAR基因对山羊产羔性状相关研究尚未报道，本研究以卵巢组织cDNA 为模板，PCR扩增黔北麻羊StAR基因的CDS 区发现与山羊StAR基因序列相比共有4 处突变，其中2 处为同义突变，不引起氨基酸的改变，2 处为错义突变，分别为丙氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸突变为精氨酸，但比对成功率高达99.51%，氨基酸改变是否会导致基因序列以及功能的改变还有待进一步验证。另外，黔北麻羊StAR 是一种定位在线粒体中的不稳定疏水性蛋白，与其作用定位相符；同时黔北麻羊StAR基因编码序列与绵羊的同源性最高，遗传距离最近，亲缘关系最好、与哺乳动物的同源性均保持在较高水平，在进化树聚集为一个大的分支，证实黔北麻羊StAR基因编码序列在不同哺乳动物中均具有较高的保守性，但其与鸡的同源性较低、遗传距离也相对较远，这证实黔北麻羊StAR基因编码序列同时具有良好的种属特异性，符合自然遗传进化规律。本研究还得出黔北麻羊StAR基因编码序列存在23 个磷酸化位点，表明此基因易发生信号传导，从而对细胞生长发育产生影响。

另外，StAR基因在单、多羔黔北麻羊母羊性腺组织中均有表达，且在卵巢中的表达量最高，与Fatemeh等[19]研究证实类固醇合成急性调节蛋白高表达于卵巢组织的结论相符。贵州大学生命科学学院前期以香猪卵巢组织为模板并采用转录组测序技术发现StAR基因在高产仔香猪卵巢组织中的表达极显著高于低产仔香猪，其验证结果与转录组测序趋势相符[20]。黄龙等[21]以高、低产仔数约克夏母猪为研究对象的转录组测序数据也表明StAR基因高表达于高产仔约克夏母猪中，从而推测StAR基因可作为猪产仔数的候选基因。本研究结果与上述研究结果相符，卵巢作为雌性动物的重要生殖器官，对山羊产仔数起着直接调控作用，结合本研究数据提示StAR基因可能作用于卵巢并可能对山羊的产羔数量具有一定的促进作用。

4 结 论

本研究发现StAR基因在单、多羔黔北麻羊母羊的下丘脑-垂体-性腺（卵巢、输卵管、子宫）轴中均有表达，与NCBI 中山羊StAR基因的CDS 区序列吻合度高达99.53%，共有4 处突变，编码区包含858 个碱基，共编码285 个氨基酸，其蛋白质二级结构主要由α-螺旋与无规则卷曲构成，该蛋白最有可能位于线粒体中。另外，通过构建系统进化树分析认为黔北麻羊与绵羊的亲缘关系最近。