腌制过程中亚硝酸钠对羊肉脂肪酸组成以及脂质氧化的影响

姬晓颖，马国源，陈耀祥，金锦伟，余群力

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃中天羊业股份有限公司，甘肃 定西 743000；3.青海5369生态牧业科技有限公司，青海 果洛 814000)

肉的腌制是肉品贮藏的一种传统手段，也是肉品生产常用的加工方法.亚硝酸钠在肉制品加工的过程中,主要用作发色剂、防腐剂和抗氧化剂[1].肉在腌制过程中添加亚硝酸盐会产生独特热稳定的腌制颜色，可明显改善肉类制品的感官品质[2].亚硝酸盐可抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和产气荚膜杆菌等的生长繁殖，有利于肉制品的贮藏和货架期的延长[3-4].亚硝酸盐可以防止肉制品酸败，延长其保质期[5]，因此在腌制肉制品过程中使用亚硝酸盐已经非常普遍.但是在腌制肉制品中如果亚硝酸盐添加量超过国标最大使用量150 mg/kg时，就会对人体产生毒副作用[6-7].随着公众食品安全意识的提高，人们对肉制品中添加亚硝酸盐持消极态度，致使肉制品中添加亚硝酸盐的量被肉品腌制研究关注与重视.

虽然世界各国的肉类研究机构和生产厂家都在不断积极研发一种经济适用、安全可靠、能代替亚硝酸钠的肉品发色剂，如尝试用麦芽酚、抗坏血酸、葡萄糖酸铁、柠檬酸铁等来替代亚硝酸钠，然而这些物质无论在发色效果、持久性、稳定性、防腐、呈味等方面都效果不理想，到目前为止还没有找到完全替代亚硝酸钠的添加剂[8-9].因此国内外的肉类加工企业仍采用亚硝酸钠作为肉品发色剂来获得理想的色泽和风味，延长保质期[10].目前需要解决的问题是如何减少亚硝酸钠的用量，所以研究亚硝酸钠的使用量对腌肉制品脂质氧化的影响具有十分重要意义.

因此本研究以羊肉作为研究对象，探讨腌制过程中不同亚硝酸钠添加量对羊肉脂肪酸组成以及脂质氧化程度的影响，以期能为腌制羊肉制品的脂质氧化及质量调控提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验取样于甘肃省定西市中天羊业股份有限公司，随机选取胴体质量相近、健康的6～9月龄大尾寒羊9只，屠宰后采集臀肌，将肉样采集后清洗血液，剔除脂肪、筋膜和结缔组织，沥干，放入保鲜袋中4 ℃运输回实验室.

亚硝酸钠、乙醇、甲醇、异丙醇、丙二醛、氢氧化钾、氯化钠、氯仿、硫氰酸铵、氯化亚铁、三氯乙酸、正己烷、浓硫酸等均购于天津光复科技发展有限公司，均为分析纯.

1.2 仪器

电子天平FA2004B(上海佑科仪器有限公司)；AB-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；水浴锅(北京科伟永兴仪器公司)；冰箱(青岛海尔电冰箱股份有限公司)；高速台式离心机GT10-1(北京时代北利离心机有限公司)； 7000D GC-MS联用仪(美国Agilent公司)等.

1.3 样品处理

将羊肉切割成约3 cm×3 cm×3 cm均匀小块，向其中均匀注射0、50、100、150 mg/kg的NaNO2.随后置于滚揉机中滚揉12 h，期间每滚揉30 min，静止30 min，放置在4 ℃的冰箱中腌制，在0、12、24、48、72和168 h时进行取样.其中，色度以及肌红蛋白含量直接测定，对于不便立即测定的指标，用铝箔纸包裹避光，避免脂质光敏氧化的发生，置于-80 ℃冻藏待测.

1.3.1 色度 肉色采用CR-10型色差仪，将色彩色差计调至L*、a*、b*色域系统进行测定.肉样沿肌纤维垂直的方向切取厚度不低于2 cm的肉块，将肉样新切面朝上平放在托盘上，置4 ℃避光静置30 min后，在其切面上选取6个点进行测定，取平均值[11].因为在弱酸性环境下亚硝酸呈不稳定状态，继续分解为亚硝基和NO，亚硝基会与肉制品中的肌红蛋白和血红蛋白结合，产生亚硝基肌红蛋白和亚硝基血红蛋白，从而使肉品呈现鲜红色，改变肉品的a*值，所以本试验只测定了a*值.

1.3.2 硫代巴比妥酸值(TBARS) 采用国标 GB 5009.181-2016[12]测定.

1.3.3 过氧化值(POV) 采用国标 GB 5009.227-2016[13]测定.

1.3.4 脂肪酸含量 参考O′Fallon等[14]的方法测定，根据具体情况作稍微的修改.将真空包装袋中的肉样在室温下解冻12 h，用刀剥离并剔除肌肉表面脂肪，将样品置于研钵中加入液氮研磨，然后称取1.0 g研磨后的样品置于具塞试管，分别加入0.7 mL浓度为10 mol/L的KOH溶液和5.3 mL无水甲醇，并在55 ℃恒温下水浴1.5 h，同时每20 min振摇试管5 s.水浴结束后，取出试管，在自来水下将其冷却到低于室温，然后再加入0.58 mL浓度为12 mol/L的H2SO4溶液，在55 ℃下继续恒温水浴1.5 h进行游离脂肪酸甲酯化，同时每20 min振摇5 s.水浴结束后,取出试管，用自来水将其冷却至低于室温，再加入3 mL正己烷摇匀后转移至离心管，以3 000 r/min的速度离心5 min，取上清液，并利用有机相过滤膜将其过滤到样品瓶，放于-20 ℃待GC检测.

色谱柱：DB-23石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25μm，美国Agilent公司)；进样口：250 ℃，分流比20∶1；进样量:1 μL；载气为He气，柱流速1 mL/min；升温程序：初温50 ℃，保持4 min，10 ℃/min升温至150 ℃，保持4 min，5 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min.

质谱条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子轰击能70 eV，扫描范围15～550 m/z，辅助温度230 ℃.

化合物经计算机检索同时与NIST Library谱库的标准质谱图对照，结合相关文献，确定各挥发性化合物的化学成分，仅报道匹配度大于800(最大值1000)的鉴定结果.

1.3.5 脂质氧化产物 参考Alicia等[15]的方法并稍作修改.采用SPME-GC-MS技术测定样品中挥发性化合物的种类及含量.取l0 g肉样，与1 g NaCl混匀后装入顶空萃取瓶中密封，80 ℃水浴40 min充分熟制后，将萃取头插入瓶中萃取40 min，取出萃取头进行GC-MS分析.

色谱条件：色谱柱为Thermo TG-WAX(60 m×0.25 mm，0.5 μm).升温程序:色谱柱起始柱温35 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min.载气(He)流速0.8 mL/min，不分流.进样解吸温度240 ℃，解吸2 min.

质谱条件:电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，灯丝电流200 μA，接口温度240 ℃，检测电压350 V，扫描质量范围为35～350 m/z.

挥发性化合物定性与定量：用TuborMass4.1.1数据处理系统，对GC-MS结果进行分析，通过对比系统自带的NBS、Nist等数据库进行解析，各物质峰所得质谱图与标准数据库进行比对，根据其匹配度鉴定各挥发性化合物.并用相对离子丰度表示各种化合物的相对含量.

1.3.6 肌红蛋白相对含量测定 参考Krzywicki等[16]的方法略有改动.取肉样5 g，加入20 mL 0.04 mol/L pH值为6.8的磷酸钠缓冲液匀浆25 s.匀浆液在4 ℃冰箱中放置1 h，然后在3 500 r/min转速下离心30 min.上清液经滤纸过滤，用同样的缓冲液补足至25 mL，测定其在525、545、565、572 nm处的吸光度.氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白相对含量计算公式为:

COMb=(0.882A575/A525-1.267A565/A525+0.809A545/A525-0.361)×100%

CMMb=(-2.514A572/A525+0.777A565/A525+0.8A545/A525+1.098) ×100%

式中：COMb：氧合肌红蛋白相对含量，%；CMMb：高铁肌红蛋白相对含量，%；Aλ：相应波长下的吸光度

2 结果与分析

2.1 色度

色泽是反应羊肉感官品质的重要指标，色泽很大程度上影响消费者的喜好[17].a*值的变化与肌红蛋白(Mb)的含量和化学状态密切相关.由表1可得，a*值在24 h内有上升趋势，24 h后逐渐趋于稳定或者下降；且未添加亚硝酸钠的处理a*值低于添加亚硝酸钠的处理(P<0.05).这与赵晶[18]不同贮藏条件下羊肉品质及其DNA质量的研究结果相似.未添加亚硝酸钠的肉样在0～24 h时a*值升高的原因很可能就是因为刚切开的肉放置一段时间，肌肉中的肌红蛋白与氧气接触，变为氧合肌红蛋白，肉色表现为鲜红色；24 h以后肉表面的氧合肌红蛋白进一步被氧化成褐色的高铁肌红蛋白，肉的颜色变暗，检测到的红度值相对较低；而添加亚硝酸钠后，肉样中的肌红蛋白与亚硝酸钠反应可生成亚硝基肌红蛋白，呈粉红色[19]，因此其a*值较未添加亚硝酸钠的均有所上升.且当亚硝酸钠浓度为100 mg/kg时，a*值更为稳定；腌制168 h时，亚硝酸钠浓度为100 mg/kg的肉样a*值比未添加组的高39.21%.

表1 腌制过程中亚硝酸钠对羊肉a*值的影响

2.2 硫代巴比妥酸值(TBARS)

TBARS值表征反应中氧化产物MDA(丙二醛)的质量分数，与脂肪的氧化程度成正比[20].表2可得，由于脂肪的氧化，羊肉在腌制过程中所有肉样TBARS值均缓慢升高，这与林玉海[21]的研究结果相似.而且在整个腌制过程中添加亚硝酸钠的肉样TBARS值明显低于未添加亚硝酸钠的肉样，在腌制24 h后各肉样中MDA含量有显著性差异(P<0.05)，这可能是由于亚硝酸钠可以与不饱和脂肪酸反应形成稳定的脂质衍生物抑制脂质氧化，不仅提高了肉类产品的稳定性，而且可以防止酸败，延长其保质期.当亚硝酸钠的浓度为100 mg/kg时，MDA含量的上升趋势更为缓慢.腌制168 h时，浓度为100 mg/kg肉样的MDA含量比未添加的低14.64%.

表2 腌制过程中亚硝酸钠对羊肉TBARS值的影响

2.3 过氧化值(POV)

过氧化值是表示油脂和脂肪酸氧化程度的一个指标[22].由表3可得，由于脂肪的氧化，氢过氧化物含量逐渐增加，羊肉在腌制过程中所有肉样POV值均缓慢升高，这可能是由于脂肪开始缓慢氧化，氢过氧化物含量逐渐增加.这与刘文营等[23]的研究结果相似.而在整个腌制过程中添加亚硝酸钠的肉样其POV值明显低于对照组，12 h后均有显著差异(P<0.05).当亚硝酸钠的浓度为100 mg/kg时，POV值的上升趋势较其他亚硝组更为缓慢.腌制168 h时，浓度为100 mg/kg肉样的POV值比未添加的低22.10%.

表3 腌制过程中亚硝酸钠对羊肉POV值的影响Table 3 Effect of sodium nitrite on the POV value of mutton during pickling

2.4 脂肪酸氧化分析

由TBARS值和POV值可知，当亚硝酸钠添加量为100 mg/kg时，对脂质氧化抑制效果最明显.因此选择腌制亚硝酸钠添加量为100 mg/kg、国标中亚硝酸钠添加量的上限150 mg/kg，以及未添加亚硝酸钠的肉样测定脂肪酸含量以及脂质氧化产物.由表4可知，单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸随时间的延长其含量逐渐下降；而饱和脂肪酸随腌制时间的延长其含量逐渐上升，这与Holman等[25]的研究结果相似.Alicia等[15]研究指出，不饱和脂肪酸含量越高，牛肉中脂质越容易发生氧化，而脂肪含量越高，脂质氧化程度越高.腌制时间为168 h时，添加亚硝酸钠浓度为100 mg/kg的肉样比未添加的不饱和脂肪酸含量低44.57%，饱和脂肪酸含量高9.51%，这可能是由于亚硝酸钠与不饱和脂肪酸的碳碳双键发生反应，产生稳定的脂质衍生物，阻止脂质的过氧化，因此亚硝酸钠对脂质氧化有一定的抑制作用[26-27].

表4 腌制过程中不同亚硝酸钠添加量对羊肉脂肪酸含量的影响

2.5 脂质氧化产物

羊肉在腌制过程中添加不同浓度亚硝酸钠对其脂质氧化产物的影响见表5.表5中列出了18种相对含量较高且对脂质氧化有影响的醛类、酮类和醇类物质.

醛类主要包括己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、苯甲醛等11种醛类物质.醛类化合物是脂质氧化产生的稳定产物，其含量的变化可用来评价肉类制品的脂质氧化程度[28].醛类化合物中含量较高的为己醛和壬醛，整体含量随腌制时间的延长呈下降趋势.己醛是脂质氧化过程中重要的氧化产物[29]，随着腌制时间的延长，己醛含量呈先上升后下降的趋势，这与Fereidoon等[28]的研究结果相似.腌制168 h时，添加亚硝酸钠浓度为100 mg/kg的肉样比未添加亚硝酸钠的肉样低15.24%.

由表5可得，醛、酮类化合物随腌制时间的延长，其含量呈下降趋势，而醇类化合物含量呈上升趋势.且添加亚硝酸钠的肉样醛酮类化合物下降趋势较为缓慢，醇类化合物上升趋势也较为缓慢，这可能是由于亚硝酸钠螯合金属离子而发挥抗氧化作用所致.

表5 腌制过程中不同亚硝酸钠添加量对羊肉脂质氧化产物相对含量的影响

2.6 肌红蛋白相对含量

氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白的相对含量决定肉的色泽，当高铁肌红蛋白含量较高时，肌肉呈现褐色[31].MbO2的含量随时间的延长呈下降趋势，在72～168 h，添加亚硝酸钠的肉样MbO2含量显著高于未添加亚硝酸钠的肉样，并且168 h时未添加和添加亚硝酸钠的MbO2与0 h的相比分别降低了57.0%和44.6%(P<0.05)，说明亚硝酸钠可以抑制MbO2的氧化.而MetMb的相对含量随时间的延长呈先上升后下降的趋势，在48 h时MetMb含量最高，未添加和添加亚硝酸钠的MetMb与0 h的相比分别升高了64.8%和37.8%(P<0.05)，且未添加亚硝酸钠的MetMb相对含量高于添加亚硝酸钠的肉样，这可能是由于亚硝酸钠分解为NO，与Fe连接，稳定Hb和Mb的结构，防止其氧化分解.说明亚硝酸钠可有效减缓肌红蛋白高铁氧化.这一结果与前面a*值的变化趋势一致.

表6 腌制过程中亚硝酸钠对羊肉肌红蛋白相对含量的影响

3 结论

经添加亚硝酸钠腌制的羊肉在4 ℃条件下可以有效降低脂质氧化速率，延长货架期.随着腌制时间的延长，不同亚硝酸钠添加量肉制品的脂质氧化程度存在显著性差异，其中亚硝酸钠添加量为100 mg/kg的脂质氧化程度最低.因此在羊肉腌制过程中添加亚硝酸钠可有效抑制脂质氧化，且当亚硝酸钠的添加量为100 mg/kg时效果较为显著.